DB22-T 1535-2011 人参中黄曲霉素B1的测定 液相色谱法.docxVIP

DB22T人参中黄曲霉素B1的测定液相色谱法

本标准规定了人参中黄曲霉素B1的液相色谱测定方法。本标准适用于人参及其制品中黄曲霉素B1含量的测定。

黄曲霉素B1是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，具有强烈的肝毒性和致癌性，被国际癌症研究机构（IARC）列为Ⅰ类致癌物。人参作为传统名贵中药材，在种植、加工和储存过程中易受到黄曲霉污染，因此建立准确、快速、灵敏的黄曲霉素B1检测方法对保障人参产品质量安全具有重要意义。

本方法采用高效液相色谱法结合荧光检测器，通过样品前处理、净化、浓缩和色谱分离等步骤，实现对人参中黄曲霉素B1的定量分析。方法检出限为0.5μg/kg，定量限为1.5μg/kg，线性范围为1.0~50.0μg/kg，加标回收率为85.2%~95.7%，相对标准偏差小于5.0%，能够满足人参中黄曲霉素B1残留检测的实际需求。

本标准引用了下列文件中的条款，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T5009.22食品中黄曲霉毒素B1的测定

GB/T18979食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1黄曲霉素B1AflatoxinB1

由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的二呋喃香豆素类化合物，分子式C17H12O6，分子量312.27。

3.2液相色谱法LiquidChromatography

以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析方法。

3.3荧光检测器FluorescenceDetector

利用某些物质在特定波长紫外光照射下能产生荧光的特性，通过检测荧光强度来确定物质含量的检测器。

4原理

试样中的黄曲霉素B1经甲醇水溶液提取，免疫亲和柱净化，浓缩后用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。黄曲霉素B1在反相C18色谱柱上分离，以甲醇水为流动相进行等度洗脱，荧光检测器激发波长365nm，发射波长440nm条件下检测。

5试剂和材料

除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

5.1甲醇：色谱纯。

5.2乙腈：色谱纯。

5.3氯化钠（NaCl）。

5.4磷酸氢二钠（Na2HPO4）。

5.5磷酸二氢钾（KH2PO4）。

5.6吐温20。

5.7黄曲霉素B1标准品：纯度≥98%。

5.8黄曲霉素B1标准储备液：准确称取黄曲霉素B1标准品1.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成100μg/mL的标准储备液，20℃避光保存。

5.9黄曲霉素B1标准工作液：用甲醇将标准储备液逐级稀释至1.0μg/mL，4℃避光保存。

5.10磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）：称取8.0g氯化钠、0.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾，溶于900mL水中，用磷酸调节pH至7.4，加水定容至1000mL，加入0.5mL吐温20，混匀。

5.11甲醇水溶液（70+30）：取70mL甲醇与30mL水混合均匀。

5.12免疫亲和柱：对黄曲霉素B1具有特异性吸附能力，柱容量≥200ng。

6仪器和设备

6.1高效液相色谱仪：配有荧光检测器。

6.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。

6.3均质器：转速不低于10000r/min。

6.4离心机：转速不低于4000r/min。

6.5旋涡混合器。

6.6氮吹仪。

6.7固相萃取装置。

6.8超声波清洗器。

6.9有机相滤膜：0.22μm。

7分析步骤

7.1试样制备

取代表性人参样品，粉碎后过60目筛，混匀，备用。

7.2提取

称取5.0g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入25mL甲醇水溶液（70+30），均质提取2min，以4000r/min离心5min，取上清液待净化。

7.3净化

取5.0mL上清液，加入20mL磷酸盐缓冲溶液，混匀后以1~2滴/秒的速度通过免疫亲和柱，待液体完全流出后，用10mL水淋洗免疫亲和柱，弃去流出液。用1.5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于2mL离心管中，40℃氮吹至近干，用1.0mL甲醇溶解残渣，经0.22μm有机相滤膜过滤，供液相色谱分析。

7.4色谱条件

7.4.1色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或相当者。

7.4.2流动相：甲醇水（45+55）。

7.4.3流速：1.0mL/min。

7.4.4柱温：30℃。

7.4.5进样量：2