DB53-T 876-2018 甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程.docxVIP

DB53T8762018甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程

1范围

本标准规定了甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤、结果判定及质量控制要求。

本标准适用于甘蔗植株、种茎及繁殖材料中甘蔗白叶病植原体（CandidatusPhytoplasma）的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

NY/T1493植物病原植原体检测规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1甘蔗白叶病SugarcaneWhiteLeafDisease

由植原体（CandidatusPhytoplasma）引起的甘蔗系统性病害，主要症状表现为叶片褪绿白化、植株矮化、分蘖增多，严重时导致甘蔗产量和品质显著下降。

3.2巢式PCRNestedPCR

一种通过两轮PCR扩增提高检测灵敏度和特异性的技术，第一轮PCR使用外引物扩增目标片段，第二轮PCR使用内引物在第一轮产物基础上进行二次扩增。

3.3植原体Phytoplasma

一类无细胞壁、专性寄生于植物韧皮部筛管细胞的原核生物，属于软壁菌门（Tenericutes），可引起多种植物病害。

4原理

甘蔗白叶病病原植原体16SrRNA基因具有高度保守性，本标准基于该基因序列设计特异性引物，通过巢式PCR技术对样品DNA进行两轮扩增。第一轮PCR使用外引物对植原体16SrRNA基因进行初步扩增，第二轮PCR使用内引物在第一轮扩增产物基础上进行特异性扩增，通过电泳检测特异性条带，实现对甘蔗白叶病病原的准确检测。该方法检测灵敏度高，可检测低浓度的植原体DNA，特异性强，能够有效区分甘蔗白叶病植原体与其他相关植原体。

5试剂与材料

5.1主要试剂

5.1.1DNA提取试剂：CTAB提取缓冲液（2%CTAB，100mmol/LTrisHClpH8.0，20mmol/LEDTApH8.0，1.4mol/LNaCl），氯仿:异戊醇（24:1），异丙醇，70%乙醇，TE缓冲液（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）。

5.1.2PCR反应试剂：10×PCR缓冲液，25mmol/LMgCl?，10mmol/LdNTPs，5U/μLTaqDNA聚合酶，无菌超纯水（应符合GB/T6682中一级水的要求）。

5.1.3电泳试剂：50×TAE电泳缓冲液，DNA分子量标记（100bpDNALadder），6×DNA上样缓冲液，10mg/mL溴化乙锭（EB）或其他安全核酸染料。

5.2引物序列

5.2.1第一轮PCR外引物：

P1：5AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT3

P7：5CGTCCTTCATCGGCTCTT3

5.2.2第二轮PCR内引物：

R16F2：5GAAACGACTGCTAAGACTGG3

R16R2：5TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG3

5.3阳性对照

甘蔗白叶病植原体阳性对照DNA，浓度约为50ng/μL，20℃保存。

5.4阴性对照

健康甘蔗植株DNA，浓度约为50ng/μL，20℃保存。

5.5空白对照

无菌超纯水，应符合GB/T6682中一级水的要求。

6仪器设备

6.1高速冷冻离心机：转速≥12000r/min，温度范围4℃~25℃。

6.2PCR扩增仪：温度控制精度±0.5℃，具备梯度升温功能。

6.3电泳仪：输出电压0~300V可调，输出电流0~400mA可调。

6.4凝胶成像系统：配备紫外或蓝光透射仪，分辨率≥300万像素。

6.5微量移液器：量程分别为0.5~10μL、10~100μL、100~1000μL。

6.6恒温水浴锅：温度控制精度±1℃，温度范围室温~100℃。

6.7超净工作台：符合YY准要求。

6.8电子天平：精度0.0001g。

6.9高压灭菌锅：温度控制范围室温~134℃，压力控制范围0~0.25MPa。

6.10冰箱：4℃冷藏室和20℃冷冻室。

6.11涡旋振荡器。

6.12微量离心管：1.5mL、0.2mL，PCR级。

6.13PCR反应管：0.2mL，薄壁，带盖。

6.14电泳槽：适用于琼脂糖凝胶电泳。

7样品采集与保存

7.1采样部位

选择具有典型白叶病症状的甘蔗叶片，以中脉部位为主；无症状样品应采集植