重组质粒构建课件课件.pptVIP

DNA重组质粒的构建;基因克隆genecloning

应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。

核心技术：DNA重组技术

（recombinantDNAtechnique）

;基因克隆的基本程序：

分—切—接—转—筛

PCR酶切连接转化转染抗性或标记筛选

目的基因DNA片段的获得

外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组

重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞

重组DNA分子克隆的筛选和鉴定

目的基因或其表达产物的纯化和鉴定

基因克隆技术的特点：

1.可在体外人工的,有目的的,根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复；

2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。;基因克隆示意图;胰岛素

人生长激素

干扰素

白细胞介素2

粒细胞集落刺激因子

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

红细胞生成素EPO

组织纤溶酶原激活剂

生长激素

促生长素

抗血友病因子Ⅷ

脱氧核糖核酸酶

葡糖脑苷脂酶

鼠单克隆抗体;例：

干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是：

从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。

酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。;DNA重组操作过程;重组质粒构建：目的DNA的PCR扩增

DNA片段和载体的酶切

片段DNA与载体的连接

载体：plasmid（primary）

工具酶：限制性内切酶

连接酶

;常见的基因工程载体;载体的基本结构单元：

1.复制起点

2.克隆位点

3.筛选标记

其他条件：

4.适当大小

5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。;质粒(Plasmid);通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。

质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。

;13;质粒DNA的特征;;（四）人工构建质粒的基本元件;pBR322plasmid是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备：

复制起点:Ori

克隆位点:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI

筛选标记:Ampr。

;T-vectorPCR产物亚克隆载体;T—Vector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

T-vector克隆PCR产物时用高效连接液LigationSolutionI可以在极短的时间内(30分钟～1小时)完成连接反应，大大地方便了实验操作。

用途

克隆PCR产物。

对克隆后的PCR产物使用M13primers进行DNA测序。;20;原核生物表达载体

Bacterialexpressionvector;复制起点

克隆位点

筛选标记

启动子﹡

转录终止序列﹡

核糖体结和位点：起始密码子ATG和SD序列（翻译识别）;23;24;真核生物表达载体

（mammalianexpressionvector);真核生物表达载体的结构单元;27;LocationofFeatures

PCMVIE:

CMVIEenhancer:1-659

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