肿瘤ngs质控判定标准.docVIP

肿瘤ngs质控判定标准

样本层面。

1.样本类型与质量。

组织样本：肿瘤组织样本应避免严重自溶、腐败，组织完整性良好。一般要求新鲜组织样本在离体后尽快处理，若无法及时处理，需妥善保存于合适的固定液（如10%中性福尔马林固定24小时内）。研究表明，超过24小时固定的福尔马林样本，DNA降解风险显著增加，约30%的样本会出现测序数据质量下降。

血液样本：对于液态活检的血液样本，应采用合适的采血管（如EDTA抗凝管），采集后及时离心分离血浆或血清，避免样本长时间放置导致细胞裂解，影响游离DNA的质量。有数据显示，血液样本在室温放置超过4小时，游离DNA浓度会降低约20%，且片段化程度改变，影响测序准确性。

2.样本量。

组织样本：不同组织类型要求不同，一般实体肿瘤组织样本量不少于10mg，以保证有足够的核酸用于后续提取和测序。例如，肺癌组织样本量不足10mg时，成功提取高质量DNA用于NGS测序的比例仅为40%左右。

血液样本：血浆样本一般不少于5ml，血清样本不少于3ml。当血浆样本量低于3ml时，检测到低丰度肿瘤基因突变的灵敏度会降低约30%。

核酸提取层面。

1.核酸浓度。

DNA：提取的肿瘤DNA浓度应满足后续建库要求，一般要求浓度不低于50ng/μl。浓度过低可能导致建库失败或测序数据量不足。据统计，DNA浓度低于30ng/μl时，建库成功率仅为60%。

RNA：对于RNA提取，浓度一般要求不低于100ng/μl，以保证后续反转录及文库构建的顺利进行。当RNA浓度低于80ng/μl时，约45%的样本无法获得高质量的cDNA文库。

2.核酸纯度。

DNA：A260/A280比值应在1.82.0之间，A260/A230比值应在2.02.5之间，表明DNA纯度较高，蛋白质、盐等杂质污染较少。若A260/A280比值低于1.8，提示可能有蛋白质污染，会影响后续酶切、连接等反应；若A260/A230比值低于2.0，说明可能存在盐离子等小分子杂质污染，会降低测序效率。研究发现，A260/A280比值在1.61.8之间时，测序数据的错误率会升高约15%。

RNA：A260/A280比值应在1.92.2之间，A260/A230比值应在2.02.5之间，同时RNA完整性数值（RIN值）应不低于7.0。RIN值低于7.0时，RNA降解严重，会导致转录本覆盖度不均一，影响基因表达定量的准确性，约55%的低RIN值样本无法准确检测到低表达基因。

文库构建层面。

1.文库浓度。

构建好的文库浓度一般要求在2nM10nM之间，以保证在测序仪上有合适的上样量，获得足够的数据量。文库浓度过低，测序数据量可能不足；过高则可能导致测序通道堵塞、数据质量下降。当文库浓度低于1nM时，平均测序深度会降低约40%；高于15nM时，测序错误率会升高约20%。

2.文库片段大小。

文库片段大小应符合预期范围，一般肿瘤NGS文库片段大小在300bp500bp之间。片段大小分布不均一或不符合预期，可能影响测序的准确性和数据质量。例如，片段过大或过小，会导致测序过程中信号强度不一致，影响碱基识别，约30%的片段大小异常文库会出现较高比例的低质量测序reads。

测序层面。

1.测序数据量。

对于肿瘤体细胞变异检测，一般全外显子测序数据量要求不低于10G，靶向测序数据量根据panel大小而定，一般每个样本数据量不少于1G。足够的数据量才能保证对肿瘤基因组变异的有效覆盖和准确检测。研究表明，全外显子测序数据量低于8G时，漏检低频体细胞变异的概率约为25%；靶向测序数据量低于0.8G时，对低丰度突变的检测灵敏度会降低约35%。

2.测序深度。

3.碱基质量值。

测序得到的碱基质量值（Q值）应满足一定标准，一般要求Q30比例不低于80%。Q30表示碱基识别错误率小于0.1%，Q30比例越高，测序数据质量越好。当Q30比例低于70%时，测序数据的错误率明显增加，会影响变异检测的准确性，约40%的低Q30比例样本会出现假阳性变异结果。

数据分析层面。

1.比对率。

测序reads与参考基因组的比对率应不低于90%。比对率过低可能提示样本存在污染、文库构建问题或测序数据质量差等。当比对率低于80%时，约35%的样本无法准确进行后续的变异分析，因为大量reads无法正确定位到参考基因组上，影响变异检测的可靠性。

2.变异检测准确性验证。

通过与已知标准品或金标准方法（如Sanger测序）进行对比验证，变异