特定寡核苷酸.PPTVIP

补骨脂素与DNA中碱基的作用（2）最适诱变剂量选择剂量的大小一般是以诱变后的死亡率与形态变异率来确定的，剂量大则死亡率大，剂量小则相反。但对某些菌株，尤其是高产菌株剂量达到一定程度时，形态变异率与正变率的最适剂量是不一致的，与负变率是吻合的。在实践中，正突变的最适剂量可采用最高形态变异剂量的1/3。剂量大小问题难以定论。应该说，正变株变异频率提高幅度大的诱变剂量即为最适剂量。剂量问题除了考虑出发菌株的特性和诱变剂性质以外，还应根据自己的实验结果来确定。在判断诱变剂量时，采用抗药性突变比较可靠。剂量大小常以致死率和变异率来确定。诱变剂对产量性状的诱变作用，大致有以下趋势：处理剂量大，杀菌率高（90%～99%），在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少；但在少量正变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株。长期诱变的高产菌株正突变率的高峰多出现在低剂量区，负变率在高剂量时更高；高剂量处理，正变株出现少，往往负突变大于正突变。对诱变史短的低产菌株，情况往往相反，正变株的高峰比负变株高的多。小剂量处理，杀菌率50%～80%，单位存活细胞中正变株多，但大幅度提高产量的菌株可能较少。5、诱变剂的处理方式分为单因子处理和复合因子处理2种。一般认为，单因子处理不如复合因子处理效果好。但是，对某菌株可能确实有效，而且可以减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多等弊病，使筛选工作趋向简单化，当然突变率要低，突变类型也较少。复合因子（2种以上诱变因子）处理，利用不同诱变剂对基因作用位点的专一性甚至特异性，取长补短，动摇DNA分子上多种基因的遗传稳定性，以弥补某种不亲和性或热点饱和现象，容易得到更多突变类型，适合于遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理，能导致较大的突变。又分为如下几种类型：（1）两个以上因子同时处理。（2）不同诱变剂交替处理：通常以化学因子和物理因子交替处理效果较好，诱变剂量要适中或偏低。（3）同一种诱变剂连续重复使用：经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时后（细菌或酵母），使细胞分裂1-2代，接着再处理；有时还要反复多次，最后进行分离筛选。一般选用诱变能力强的广谱诱变剂，处理代数不能过多。（4）紫外线光复活交替处理：紫外线照射后的菌体或菌悬液，暴露在日光中一段时间，接着用剂量更大的紫外线继续照射，再让其光复活。多次反复，可增加变异率，提高变异幅度。（5）诱变剂处理时间和诱变效应的关系：先用弱诱变因子，后用强诱变因子处理往往具有协同效应。处理之前要做预备实验，或参考前人的经验。实践中常用的诱变方式：直接处理方式，将菌悬液用物理、化学因子处理，然后分离；生长过程处理，适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl，秋水仙碱等。首先将诱变剂加入到培养基中，混匀，倒制平板，然后分离培养菌体，生长过程中诱变；或者先倒制平板，诱变剂和菌悬液混合，然后涂布、培养；或者将诱变剂低浓度地加入（也可分批加入）液体培养基，摇床培养。不溶于水的EMS、DES等诱变剂，先用少量75%酒精或吐温80溶解，然后加入。6、影响突变率的因素（1）菌种遗传特性：5-BU等对静止或休眠细胞不起作用；其它诱变剂也对生活旺盛细胞诱变效果更强。（2）菌体细胞壁结构：丝状真菌孢子壁厚，表面有蜡质，要采用更高诱变剂处理，或用一定浓度的洗衣粉、脂肪酶或表面活性剂处理，使诱变剂能进入细胞。（3）环境条件影响1）诱变前预培养和诱变后培养：采用营养丰富的培养基，如预培养基中加入一些咖啡因、蛋白胨、酵母膏、丫啶黄、β-重氮尿嘧啶、嘌呤等物质，能显著提高突变频率。后培养是指诱变处理后的菌悬液，不直接分离，而是立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。培养基中加入足够的酪素水解物、酵母膏等含各种氨基酸、生长因子、ATP等营养物质。后培养对化学诱变剂处理和紫外线照射后的菌体突变率影响较大，对电离辐射处理的影响不明显。2）温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响：化学诱变剂要在最适的、稳定pH范围才表现良好的诱变效应；辐射因子和紫外线的诱变效应与供氧有密切关系，菌悬液要薄，要搅拌以提供氧气。3）平皿密度效应：在平板上分离时，平板上的密度要适中，不能过大。抗生素作为诱变剂用于菌种选育b-内酰胺抗生素：抑制细胞壁的合成多烯类抗生素（制霉菌素、两性霉素B）：作用于细胞膜的Na+－K+－ATP酶、磷酸转移酶等，损伤含有麦角甾醇等的真菌细胞膜而造成细胞内含物向外泄漏。Eg制霉菌素处理产黄青霉获得高产青霉素。大环内酯和氨基环醇类抗生素：抑制mRNA聚合酶、氨酰tRNA合成酶、肽酰基转移酶和各种蛋白质因子的活性来抑制蛋白质合成，从而干扰生物体的正常复制抗肿瘤抗生素：使微生物菌种的细胞壁、细胞质膜、核酸和蛋白质的生物