汉族人MBL全长基因在CHO细胞中的高效表达与功能探究.docxVIP

汉族人MBL全长基因在CHO细胞中的高效表达与功能探究

一、引言

1.1研究背景与意义

甘露糖结合凝集素（Mannan-BindingLectin，MBL）作为天然免疫中的关键蛋白，在机体抵御病原体入侵的过程中发挥着不可替代的作用。它能够特异性地识别病原体表面以甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺等为末端糖基的糖结构，进而激活凝集素补体途径，介导调理吞噬作用，有效地清除入侵的病原体，如A组乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、奈氏脑膜炎球菌、肺炎衣原体、甲型流感病毒、HIV、白色念珠菌、小球隐孢子虫等，是天然免疫系统中重要的模式识别分子之一。

然而，血清MBL水平低下和功能缺陷与多种疾病的发生发展密切相关。研究表明，MBL缺陷可导致机体对多种病原体的易感性增加，引发反复感染，如反复呼吸道感染在儿童中的发病风险与MBL基因突变密切相关。同时，MBL缺陷还与妇女习惯性流产、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等存在关联。引起MBL缺陷的主要原因是MBL基因的点突变，位于MBL结构基因外显子1的3个点突变（CGT52T、GGC54GAC和GGA57GAA）较为常见，其相应的基因型分别为D、B、C型，而野生型为A型，这些突变呈常染色体显性遗传，使得突变个体血清MBL水平低下，甚至可能导致MBL分子功能受损。

针对MBL缺陷相关疾病，MBL补充治疗成为一种潜在的治疗策略。目前，血浆纯化的天然MBL补充治疗已通过临床一期试验，展现出一定的治疗潜力。但该方法存在诸多局限性，人血浆中MBL含量极低，导致提取成本过高，且来源受限于血液供应，难以满足大规模的临床需求。此外，血制品还存在潜在的病毒污染风险，如HCV、HIV等，同时，复杂的血液成分也增加了提取高纯度MBL的难度，阻碍了对MBL生物功能的深入研究。

因此，体外制备大量与天然MBL结构功能相近的重组蛋白具有重大意义。中国仓鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvarycells，CHO细胞）作为生物制药领域常用的表达宿主，具有易于培养、稳定性强、能够进行复杂的翻译后修饰等优势，使得其表达的重组蛋白更接近人体内源性蛋白质。在CHO细胞中表达MBL全长基因，有望获得结构和功能与天然MBL相似的重组蛋白，为MBL补充治疗提供充足的蛋白来源，同时也有助于深入研究MBL的生物功能和作用机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。

1.2MBL全长基因与CHO细胞概述

1.2.1MBL全长基因结构与功能

MBL基因位于人类第10号染色体长臂（10q21.2-24），其结构较为复杂，包含多个外显子和内含子。其中，外显子1编码N-端富含胱氨酸区和部分胶原样区，外显子2含有部分胶原样区，外显子4编码碳水化合物识别域（CRD），该区域具有C型凝集素CRD的共同特征，对于MBL识别病原体表面的糖结构至关重要。MBL基因存在多种突变类型，除了上述外显子1中的3个常见点突变外，启动子区的单核苷酸多态性（SNP）位点如-550（H/L）、-221（Y/X）等也对MBL的表达水平产生重要影响。不同的启动子基因型与结构基因突变体相互作用，导致不同种族人群间，甚至同一种族不同个体间的MBL血清水平存在显著差异。

MBL在免疫反应中主要通过两条途径发挥作用。一方面，MBL通过其CRD识别病原体表面的糖结构后，与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MASP）1和2形成复合体，激活补体凝集素途径。激活的补体系统产生一系列级联反应，生成C3b、C4b等补体片段，这些片段能够结合到病原体表面，促进吞噬细胞对病原体的吞噬作用，即调理吞噬作用；同时，补体激活过程中还会产生过敏毒素如C3a、C5a等，引发炎症反应，吸引免疫细胞聚集到感染部位，增强免疫防御。另一方面，MBL可以直接与吞噬细胞表面的胶凝素受体结合，介导直接调理作用，增强吞噬细胞对病原体的摄取和清除能力。

1.2.2CHO细胞特性与应用

CHO细胞最初是于1957年从一只成年中国仓鼠的卵巢组织中分离并建立的。其具有独特的生物学特性，细胞呈椭圆形状，通常以单层形式生长，具有较大的细胞核和胞浆。CHO细胞生长迅速，对培养条件适应性强，能够在贴壁或悬浮培养条件下生长，且易于维护。在遗传特性方面，CHO细胞的基因组具有高度的不稳定性，染色体数目通常为22条。虽然这种不稳定性可能导致在长时间培养过程中出现基因重排、目的基因的突变、表观遗传学的基因沉默等问题，但也使得CHO细胞在适应不同的培养条件和生产需求