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PouV基因标记在鸡体细胞诱导重编程中的机制与应用研究

一、引言

1.1研究背景与意义

细胞重编程作为生命科学领域的前沿热点，自20世纪末兴起以来，取得了长足的发展。2006年，日本科学家山中伸弥首次成功将成体小鼠的皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），这一突破性成果开启了细胞重编程技术的新纪元。细胞重编程是指在不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰、改变表观遗传状态等方式，将一种细胞类型转变为另一种细胞类型的过程。该技术涉及将几个关键基因（如Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）引入成体细胞中，触发细胞内程序的重置，使其回到类似胚胎干细胞的多能状态，为后续的应用研究打下了基础。

鸡作为重要的家禽动物，在农业生产和生物医学研究中都具有举足轻重的地位。对鸡体细胞进行诱导重编程，能够为构建鸡类疾病模型、开展药物筛选以及保存物种资源等提供全新的解决方案。通过将鸡体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），可以在实验室环境中模拟鸡的胚胎发育过程，深入研究疾病的发病机制，为开发新型治疗方法提供理论依据。在物种资源保存方面，对于珍稀或濒危的鸡种，将其体细胞转化为iPSCs并进一步诱导分化为相应的组织或器官，能够实现物种资源的长期保存，对于保护生物多样性和维护生态平衡意义重大。

PouV基因作为多能性相关基因，在鸡体细胞诱导重编程过程中发挥着关键作用。研究表明，PouV基因（Oct4同源基因）在鸡原始生殖细胞（PGCs）中显著表达，并且在PGCs体外分化过程中，其表达量伴随PGCs标记基因一起呈明显下调趋势，提示PouV在维持鸡PGCs多能性中起着重要的作用。通过对PouV基因进行标记，可以更加精准地追踪和研究鸡体细胞诱导重编程的过程，深入解析重编程的分子机制，为优化重编程技术提供理论支持。同时，这也有助于筛选出高效的重编程因子和条件，提高重编程效率和质量，推动鸡体细胞重编程技术在禽类生物研究中的广泛应用。

1.2国内外研究现状

在鸡体细胞诱导重编程研究方面，国内外取得了一定的成果。国内扬州大学李碧春、陈国宏教授团队在《NatureCommunications》发表研究论文，阐述了将鸡高度分化的成纤维细胞逆转为生殖干细胞以繁殖后代的理论和方法体系。他们通过过表达Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A(OSNL)将黑羽狼山鸡的鸡胚成纤维细胞（CEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），并通过BMP4/BMP8b/EGF进一步诱导分化为原始生殖细胞（PGCs），最终将诱导的PGC(iPGCs)移植到受体中，成功产生了具有供体特征的体细胞来源鸡。国外也有相关研究致力于优化鸡体细胞重编程的方法和条件，探索不同重编程因子组合对重编程效率的影响。

在PouV基因相关研究上，武艳群等人分离19期鸡胚生殖嵴细胞，采用原始生殖细胞-体细胞共培养获得PGCs集落，通过RT-PCR检测及基因测序证实干细胞多能性相关基因PouV在鸡PGCs中均有显著表达，且在PGCs体外分化过程中，PouV表达量呈明显下调趋势，表明PouV在维持鸡PGCs多能性中发挥重要作用。然而，现有研究仍存在不足，对于PouV基因在鸡体细胞诱导重编程中的具体作用机制尚未完全明确，重编程效率和质量还有待进一步提高，缺乏高效、稳定的鸡体细胞诱导重编程体系。

1.3研究目的与内容

本研究旨在深入探究PouV基因标记鸡体细胞诱导重编程的机制和效果。具体研究内容包括：首先，构建鸡内源PouV荧光报告追踪体系，通过构建PouV基因的sgRNA载体和PouV-donor载体，实现对PouV基因的标记，为后续研究提供有效的追踪工具；其次，进行PouV荧光标记鸡体细胞诱导重编程的研究，构建Nanog、PouV和Lin28(NPL)过表达载体，转染pPouV-mCherry体细胞，通过流式分选和诱导培养，获得诱导性多能干细胞，并对其多能性进行检测和鉴定；最后，分析PouV基因在鸡体细胞诱导重编程过程中的作用机制，通过对比实验和数据分析，揭示PouV基因对重编程效率、细胞多能性维持等方面的影响。

1.4研究方法与技术路线

本研究拟采用分子生物学技术、细胞培养技术和流式细胞术等多种实验方法。在分子生物学技术方面，运用PCR技术扩增目的基因，构建重组表达载体；采用基因编辑技术如CRISPR/Cas9系统对PouV基因进行标记。细胞培养技术用于鸡体细胞、诱导性多能干细胞的培养和传代，优化培养条件，确保细胞的正常生长和分化。流式细胞术用于对转染后的细胞进行分选和鉴定，分析细胞的多能性标志物表达情况。

技术路线如下：首