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反硝化菌DNF409硝酸盐还原酶基因敲除及功能影响探究

一、引言

1.1研究背景与意义

随着工业化和城市化进程的加速，水体氮污染已成为全球面临的严峻环境问题之一。工业废水、农业面源污染以及生活污水的大量排放，使得水体中的氮含量急剧增加，远远超出了水体的自净能力。据相关研究表明，我国约有60%的河流、湖泊受到不同程度的污染，其中50%是由面源污染引起的，而氮素污染对水污染的贡献率高达81%。氮污染不仅会导致水体富营养化，引发藻类大量繁殖，破坏水生生态系统的平衡，还会对人类健康产生严重威胁。例如，硝酸盐在进入人体后可还原成亚硝酸盐，与人体中的胺类化合物和氨基酸进一步反应，形成强致癌的亚硝胺等亚硝基化合物，增加患胃癌等疾病的风险；直接饮用含有过量硝酸盐的水还可引起婴儿的高铁血红蛋白症。

目前，针对水体氮污染的处理方法众多，包括物理法、化学法和生物法等。物理法如离子交换、反渗透等，虽然能够有效地去除氮污染物，但成本较高，且容易产生二次污染；化学法如活泼金属还原法、催化还原法等，需要使用大量的化学药剂，同样存在成本高和二次污染的问题。相比之下，生物反硝化法作为一种绿色、环保且经济的处理方法，受到了广泛的关注和研究。生物反硝化法是利用反硝化菌将硝酸盐和亚硝酸盐还原为氮气，从而实现水体中氮的去除。这种方法不仅能够有效地降低水体中的氮含量，还具有能耗低、无二次污染等优点，符合可持续发展的理念。

反硝化菌DNF409是一种从底泥沉积物和成功修复的中国湖泊里分离出来的高效反硝化细菌，在水体脱氮方面展现出了巨大的潜力。研究表明，该菌株具有极强的反硝化能力，能在72h内将硝酸盐污染水体中的硝酸盐，从40μg/mL的浓度降为5μg/mL以下。然而，在实际应用过程中发现，DNF409在污水处理过程中存在着亚硝酸盐严重积累的现象。亚硝酸盐的积累不仅会对水生生物造成毒性影响，还可能导致反硝化过程的受阻，降低氮的去除效率。因此，深入研究反硝化菌DNF409，对其进行优化和改良，具有重要的理论和实际意义。

1.2反硝化菌DNF409概述

反硝化菌DNF409最初是从受污染的水体底泥沉积物以及成功修复的中国湖泊中分离得到的。通过生理生化和16SrDNA序列分析，初步判断其为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。在分类学上，芽孢杆菌属属于厚壁菌门，是一类革兰氏阳性菌，具有较强的适应性和生存能力。

在水体脱氮过程中，反硝化菌DNF409发挥着重要的作用。它能够利用水体中的有机物作为碳源和能源，在缺氧条件下，将硝酸盐逐步还原为亚硝酸盐、一氧化氮、一氧化二氮，最终还原为氮气，从而实现水体中氮的去除。研究发现，DNF409生长的最适pH为6-7，反硝化作用的最适pH为7-8。在生长的各个阶段，该菌株均具有较强的反硝化活性，最佳反硝化碳源为乙醇。当水体温度在28-30℃，C/N（质量比）大于等于8.0：1，菌体浓度达到10?Cfu/mL时，硝态氮和亚硝态氮的降解率可分别达到94.79%和99.94%，这表明DNF409在养殖水体的生物脱氮方面具有广阔的应用前景。

然而，如同许多反硝化菌一样，DNF409在反硝化过程中存在亚硝酸盐积累的问题。在污水处理过程中，当硝酸盐被大量还原为亚硝酸盐时，如果亚硝酸盐不能及时被进一步还原为氮气，就会导致亚硝酸盐在水体中积累。亚硝酸盐具有较高的毒性，会对水生生物的生长、发育和繁殖产生不利影响，甚至导致水生生物死亡。此外，亚硝酸盐的积累还可能会抑制反硝化菌的活性，影响反硝化过程的顺利进行，从而降低水体脱氮效率。因此，解决DNF409在反硝化过程中的亚硝酸盐积累问题，是提高其水体脱氮性能的关键。

1.3硝酸盐还原酶基因的功能及研究现状

硝酸盐还原酶基因在反硝化过程中起着至关重要的作用。反硝化过程是一个复杂的生化反应过程，通常分为四个连续步骤：硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐还原为一氧化氮，一氧化氮还原为一氧化二氮，最终一氧化二氮还原为氮气。其中，硝酸盐还原为亚硝酸盐是反硝化过程的第一步，也是关键步骤，而硝酸盐还原酶基因编码的硝酸盐还原酶（Nar/Nap）则是催化这一步反应的关键酶。硝酸盐还原酶能够利用电子供体提供的电子，将硝酸盐还原为亚硝酸盐，为后续的反硝化反应提供底物。

在反硝化菌中，对硝酸盐还原酶基因的研究一直是热点领域。许多研究致力于揭示硝酸盐还原酶基因的结构、功能以及其在反硝化过程中的调控机制。通过基因敲除、过表达等技术手段，研究人员发现硝酸盐还原酶基因的缺失或表达异常会显著影响反硝化菌的反硝化能力。例如，在一些反硝化菌中敲除硝酸盐还原酶基因后，菌株的硝酸盐还原能力明显下降，甚至完全丧失反硝化能力。此外，研究还发现，硝酸盐还