DNA聚合酶Klenow片段3Sanger双脱氧链终止法基本.pptVIP

三.HLA-DQA1基因座已经确定HLA-DQA1基因座可表达的等位基因有12个，反向印迹杂交法用11个等位基因寡核苷酸探针可区分其中的8种等位基因：HLA-DQA11.1HLA-DQA11.2HLA-DQA11.3HLA-DQA12HLA-DQA13HLA-DQA14.1HLA-DQA14.2HLA-DQA14.3结果判读1.先观察标准探针对照参考点对照参考点在探针条上被设计成最淡的分型点，为其它探针的最低参照。如果探针条上看不清对照参考点，就不能进行基因型判别。2.确定探针对照参考点后，以对照参考点颜色为标准，比较其他点。只有强度比对照参考点高或与之相当的斑点才能被判为阳性，表示所检测的样本存在着相应的等位基因。三.HLA-DQA基因座等位基因

反向印迹杂交分型结果四.法医学应用ASO探针杂交技术的优势：1.分型技术简单，结果判定容易。2.不需要电泳。3.结果重复性好。4.特异性好，灵敏度高，对检材质量要求低。5.操作简单，省时。五.ASO探针杂交技术的局限性1.目前所用基因座较少，加之其等位基因也少，系统的个人识别能力有限。2.由于ASO探针杂交技术依靠的是对照参考点颜色来确定待测DNA的等位基因。在混合斑分型或遇到比对照参考点颜色更浅的点时，有时会面临结果解释的困难。第三节扩增片段限制性长度多态性分析技术

（PCR-restrictionfragmentlengthpolymporphism,

PCR-RFLP）PCR技术+RFLP技术与RFLP技术不同第三节扩增片段限制性长度多态性分析技术

（PCR-restrictionfragmentlengthpolymporphism,

PCR-RFLP）一.基本原理利用PCR技术扩增基因组中特定的DNA片段（碱基顺序的差异），选择限制性内切酶切割PCR产物，由于不同个体的酶的识别位置不同，获得片段长度不同的DNA酶切片段，判断等位基因及基因型。一.基本原理（Basicprinciple）

二.PCR循环测序技术

（PCRcyclesequencingtechnology）以双脱氧链终止法为基础的标准DNA测序方法。采用热循环高效合成DNA，并结合双脱氧链终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循环中增加，称为循环测序。二.PCR循环测序技术

（PCRcyclesequencingtechnology）PCR+双脱氧链终止法二.PCR循环测序技术

（PCRcyclesequencingtechnology）基本原理步骤步骤四循环步骤重复20~40次，使链终止产物以线性方式获得扩增步骤一PCR扩增靶序列制备测序模板，DNA变性成单链步骤三退火后的引物在DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应步骤二标记引物与其中的一条链上的互补序列退火PCR+双脱氧链终止法PCR循环测序的优点（TheadvantagesofPCRcyclesequencing）简单易操作DNA模板用量少减少二级结构直接测序效果好ABCDPCR测序普通PCR引物一条两条底物dNTP/ddNTPdNTP扩增产物线性方式指数扩增PCR循环测序与普通PCR反应比较双脱氧核苷酸链终止法与PCR循环测序法的比较

双脱氧核苷酸链终止法PCR循环测序法PCR循环测序引物：32p-dATPPCR热循环高效合成DNA并结合双脱氧核苷酸终止法高效、快速模板与引物双脱氧核苷酸链终止电泳,放射自显影32p-dATP三.DNA自动测序技术（AutomaticDNAsequencingtechnology）采用荧光分子替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用四种荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此