高特异性己烯雌酚单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的构建与实践.docxVIP

高特异性己烯雌酚单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的构建与实践

一、引言

1.1己烯雌酚的概述

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），化学名称为（E）-4,4’-（1,2-二乙基-1,2-亚乙烯基）双苯酚，分子式为C_{18}H_{20}O_{2}，分子量为268.35。其是一种人工合成的非甾体雌激素类药物，具有与天然雌二醇相似的药理作用。从化学结构上看，它拥有独特的平面结构以及具有较高抗性的环状芳香环，还存在顺式和反式两种同分异构体，其中反式异构体的作用较强，常被用于医药领域。其外观为无色结晶或白色结晶性粉末，几乎无臭、无味，几乎不溶于水，可溶于乙醇、氯仿、乙醚、脂肪油以及稀氢氧化钠溶液，熔点在169-172℃，紫外最大吸收波长为242nm。

在生理作用方面，己烯雌酚能补充体内雌激素不足，可促使未成熟的女性器官及副性征正常发育，促进成熟妇女子宫内膜增生，同时使阴道上皮增生角质化。它还能减轻因更年期或手术切除卵巢所致的性腺激素水平下降而产生的性功能紊乱。此外，己烯雌酚具有抗雄激素作用，能使动物皮脂腺萎缩，减少皮脂分泌，小剂量能促进垂体前叶分泌催乳激素、促性腺激素，大剂量能抑制泌乳。在骨代谢方面，它作用于成骨细胞和破骨细胞上的雌激素受体，刺激小梁骨的形成，增加骨胶原的转换，抑制成骨细胞向破骨细胞转换，拮抗甲状旁腺激素对骨吸收的作用，增加维生素D活性，促进肠钙吸收，加强降钙素的作用。

在动物养殖历史中，己烯雌酚因其能促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重、减少脂肪、增加瘦肉率、提高饲料转化率，以及具有治疗胎衣不下、排出死胎、提高产崽率或催情等功能，曾被广泛应用于畜牧业，作为促生长剂添加到饲料中。但随着研究的深入，其危害逐渐被认识，目前世界上绝大多数国家已禁止在食品动物中使用己烯雌酚。2002年，中国农业部也规定己烯雌酚及其盐、酯制剂取消在所有食品动物的所有用途。

1.2己烯雌酚的危害

己烯雌酚在动物源性食品中的残留对人体健康造成了诸多潜在威胁。国际癌症研究机构已将己烯雌酚列为一类致癌物，其残留会对人体产生致癌风险。研究表明，长期摄入含有己烯雌酚残留的动物源性食品，如肝脏、肌肉、蛋、奶等，可能引发人体产生癌变，如乳腺癌、子宫内膜癌等。

己烯雌酚的残留还会干扰人体内分泌系统。它作为一种外源性雌激素，进入人体后可与雌激素受体结合，干扰体内正常的激素平衡。对于儿童而言，可能导致发育早熟，如女童出现乳房过早发育、月经初潮提前等现象，男童则可能出现女性化特征，如乳腺发育等。对于成年人，可能影响生殖系统的正常功能，导致生育能力下降、月经紊乱等问题。对男性来说，可能会降低雄激素水平，影响精子的生成和质量，导致不育；对女性而言，可能引发多囊卵巢综合征等疾病，影响排卵和受孕。

由于己烯雌酚在环境中降解缓慢，其残留还会对生态环境造成破坏。通过食物链的传递和生物富集作用，会对整个生态系统中的生物产生不良影响，威胁生物多样性和生态平衡。

1.3己烯雌酚检测的研究现状

目前，检测己烯雌酚的方法主要包括理化分析方法和免疫分析方法。

理化分析方法中，气相色谱-质谱联机法（GC-MS）和高效液相色谱法（HPLC）较为常用。GC-MS具有高灵敏度和高选择性，能够准确地对己烯雌酚进行定性和定量分析，可检测出极低含量的己烯雌酚残留。但该方法需要昂贵的仪器设备，前处理过程复杂，需要对样品进行提取、净化、衍生化等多个步骤，检测时间长，成本较高，难以满足大批量样品的快速检测需求。HPLC则具有分离效率高、分析速度快等优点，可直接对己烯雌酚进行分离和检测，无需衍生化步骤。不过，它同样存在仪器成本高、操作复杂等问题，对操作人员的技术要求也较高。

免疫分析方法以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低等优势受到广泛关注，主要包括放射免疫法（RIA）、酶联免疫法（ELISA）、荧光免疫分析（FIA）等。RIA利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的原理进行检测，灵敏度很高，特异性强。但其需要有同位素防护设备，仪器价格昂贵，测定程序繁琐费时，且存在放射性污染风险，在实际应用中受到一定限制。FIA用荧光素标记抗原或抗体，其中时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）法被认为是现有免疫方法中灵敏度最高的非均相免疫分析方法之一。然而，该方法需要特殊的荧光检测仪器，且荧光标记物的稳定性和荧光淬灭等问题也会影响检测结果的准确性。

ELISA是继RIA后发展起来的一种非同位素免疫检测技术，它将酶促反应的高效性与免疫反应的高度专一性有机结合。该方法不需要昂贵的仪器，操作相对简便，能够满足大批量快速测定的需求。通过优化反应条件，ELISA可获得较高的灵敏度和特异性，与其他检测方法相比，具有成本低、检测速度