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甘草转基因毛状根诱导及培养体系的构建与优化研究

一、引言

1.1研究背景与意义

甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）作为豆科甘草属多年生草本植物，在我国有着悠久的药用历史，被《神农本草经》列为上品，素有“国老”之美誉。其根和根茎中含有多种化学成分，如甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、异甘草甙、新甘草甙、新异甘草甙、甘草素、异甘草素以及甘草西定、甘草醇、异甘草醇、7-甲基香豆精、伞形花内酯等数十种化合物。这些成分赋予了甘草广泛的药用价值，在补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等方面功效显著，被广泛应用于医药、食品、化妆品等多个领域。

随着现代医学研究的不断深入，甘草在治疗肝炎、胃溃疡、心血管疾病等方面的作用也逐渐被揭示。在医药领域，甘草常被用于复方制剂中，以调和其他药物的药性，降低药物的刺激性，提高治疗效果；在食品工业中，甘草因其独特的甜味和风味，被用作天然甜味剂和食品添加剂；在化妆品行业，甘草提取物具有美白、抗炎、抗氧化等功效，被广泛应用于各类护肤品中。

然而，由于甘草生长周期较长，一般需要3-5年才能收获，且野生甘草资源因长期过度采挖，导致其生态环境遭到严重破坏，野生资源日益枯竭，已被列为国家二级保护植物。传统的甘草获取方式主要依赖于野生采集和人工种植，但野生采集面临资源保护的限制，人工种植则存在产量低、品质不稳定、种植成本高等问题，难以满足市场对甘草日益增长的需求。因此，寻找一种可持续、高效的甘草生产方式迫在眉睫。

植物组织培养技术的发展为甘草资源的可持续利用提供了新的途径。其中，转基因毛状根培养技术具有生长速度快、遗传稳定性高、次生代谢产物合成能力强等优点，能够在不依赖野生资源的情况下，实现甘草药用成分的大量生产。通过建立甘草转基因毛状根诱导及培养体系，可以有效解决甘草资源短缺的问题，保护野生甘草资源，同时为甘草的深入研究和开发利用提供稳定的材料来源，对于推动甘草产业的可持续发展具有重要的现实意义。

1.2甘草研究现状

甘草作为一种重要的药用植物，其研究涵盖了多个方面。在化学成分研究上，已从甘草中分离出甘草甜素、甘草次酸等数十种化合物，其中甘草甜素和黄酮类物质被认为是最重要的生理活性物质，主要存在于甘草根表皮以内的部分。这些化学成分的含量和种类会因甘草的种类、种植区域、采收时间等因素而有所不同。

在组织培养技术方面，国内外学者已开展了大量研究。通过对不同外植体（如叶片、茎段、根段等）的培养，探索了甘草组织培养的适宜条件，包括培养基的选择、激素的配比、培养环境的控制等。研究发现，不同外植体的诱导率和分化能力存在差异，合适的激素组合（如生长素和细胞分裂素的配比）对甘草组织的生长和分化起着关键作用。例如，在MS培养基中添加适量的6-BA和NAA，能够促进甘草愈伤组织的诱导和分化。

在次生代谢途径相关基因研究方面，随着分子生物学技术的不断发展，对甘草中参与次生代谢产物合成的关键基因的研究逐渐深入。一些与甘草甜素、黄酮类物质合成相关的基因已被克隆和鉴定，这些基因的功能研究为通过基因工程手段调控甘草次生代谢产物的合成提供了理论基础。例如，通过调控甘草中参与甘草甜素合成的关键酶基因的表达，可以提高甘草甜素的含量。

在毛状根研究进展方面，已有多种药用植物成功诱导出毛状根，并在次生代谢产物生产、生物合成机制研究等方面得到应用。然而，甘草转基因毛状根的研究相对较少，目前虽有一些关于甘草毛状根诱导的报道，但诱导效率和培养体系的稳定性仍有待提高。建立高效稳定的甘草转基因毛状根诱导及培养体系，对于深入研究甘草次生代谢产物的合成调控机制以及实现甘草药用成分的工业化生产具有重要意义。

1.3发根农杆菌诱导毛状根的研究概况

1.3.1发根农杆菌诱导形成毛状根的机制

发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）是一种革兰氏阴性土壤杆菌，其诱导植物形成毛状根的机制主要与Ri质粒（Root-inducingplasmid）密切相关。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的大质粒，上面存在两个与转化有关的重要功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。

当发根农杆菌感染植物时，首先识别受伤植物释放的诱导物，如乙酰丁香酮等小分子酚类化合物。这些诱导物与VirA的表达产物结合，激活Vir区上的其他Vir基因。Vir基因的激活促使T-DNA从Ri质粒上被切割下来，并通过一种类似于细菌接合的机制转移到植物细胞中。进入植物细胞的T-DNA进一步进入细胞核，并整合到宿主植物基因组中。

T-DNA上含有多个与毛状根生长和发育相关的基因，如rolA、rolB、rolC和rolD等基因。这些基因在