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离体花粉培养

虽然花药培养和花粉培养的目的都是在于获得单倍体植株，但是从严格的意义上讲，花药培养是属于器官培养的范畴，而花粉培养则与单细胞培养相似。在花药培养中，由于一个花药内的花粉粒在遗传上是异质的，因此，由一个花药所产生的植株，将构成一个异质的群体。如果单倍体植株是经由花粉愈伤组织的途径产生的，由于从若干花粉起源的愈伤组织常常混在一起，因此由一个花药形成的愈伤组织将会是一个嵌合体。而且，如果在花粉愈伤组织化的同时，花药壁的细胞也进行增值，那么最终所得到的愈伤组织就不可能具有纯粹的配子体起源。解决这个问题的方法是培养离体小孢子或花粉粒，并诱导它们进行雄核发育。

（一）花粉的分离方法

花粉的分离有挤压法、磁搅拌法、漂浮释放法等，前两者为机械分离方法。

挤压法是用平头玻璃棒将液体培养基中的花药挤压破碎后去掉残片，或将经过预培养的花药置于一定浓度的蔗糖溶液中，压碎、过筛、离心、收集沉淀。

磁力搅拌法是将接种于液体培养基中的花药置于磁力搅拌器上，低速转至花药透明。

漂浮释放法是利用一些植物的花药漂浮于液体培养基上能自行开裂，散出花粉的特点而设计的。将低温处理后的花粉接种于液体培养基上，培养数天后花药开裂，花粉散落到液体培养基上。再转移漂浮的花药至新鲜培养基上，继续收集花粉。

（二）花粉培养方法

1.悬滴培养法

Kameya和Hinata（1970年）的报道，在培养甘蓝和甘蓝×芥蓝杂种的成熟花粉时，为了防止花粉破裂，在4℃下的低温接种，在20℃下暗培养，由离体花粉形成愈伤组织。具体做法是，先在一张盖玻片上圈筑1个圆形石蜡“围墙”，中心装上1个石蜡柱，将1滴含有50～80个成熟花粉粒的培养液滴在石蜡柱一侧，翻转盖玻片，扣在载玻片的凹穴中央底部，盖玻片四周用石蜡封严（图6-10）。每天轻轻转到载玻片，使悬滴绕着盖玻片中央的石蜡柱流动，以达到通气的目的。

图6-10培养甘蓝花粉用的悬滴培养装置（引自Kameya,1970

图6-10培养甘蓝花粉用的悬滴培养装置（引自Kameya,1970）

A．凹穴载玻片；B.盖玻片

2.看护培养法

Sharp等（1972年）用看护培养法培养番茄的离体花粉粒，成功地获得了单倍体细胞的无性繁殖系（图6-11）。

图6-11由番茄离体花粉粒建立组织无性系的看护培养法（引自Sharp等，1972）

图6-11由番茄离体花粉粒建立组织无性系的看护培养法（引自Sharp等，1972）

具体做法是，由一个花蕾中取出完整花药，水平地置于半固体培养基表面，然后在这些花药上面覆盖一小圆片滤纸。与此同时，由另一个花蕾中取出花药，制成花粉悬浮液，密度是每0.5ml培养基含10个花粉粒。用移液管吸取0.5ml悬浮液，滴在小滤纸片上，在25℃下光照培养。约一个月后，在滤纸片上就会长出由绿色薄壁细胞组成的细胞群落。植板率高达60%。通过这种花药看护培养法得到的单细胞无性系都是单倍体。无花药看护的对照则没有形成细胞团。

3.悬浮培养法

1982年Lichter把甘蓝型油菜的小孢子从花蕾中分离出来，培养在液体培养基中并获得了胚状体，这是甘蓝型油菜小孢子培养的首次报道。这一技术较花药培养效率明显提高，并可排除体细胞组织的干扰。具体做法是：

(1)取材和表面消毒

处于单核晚期至二核早期的小孢子才能形成胚状体，这段时期称为小孢子培养的理想发育阶段。处于理想发育阶段的小孢子70%能进行分裂，其中70%可形成胚状体。大多数材料花蕾长度2.5～3.5mm处在单核晚期至二核早期，但此范围的花蕾不是均能适宜出胚，大小不恰当的花蕾的胚状体产量大幅度下降甚至不产生胚状体，导致这种情况的原因是：小孢子培养的理想发育阶段很短，花蕾长度稍有变化就可能错过这一时期，过大或过小的小孢子不仅不能形成胚状体，而且对适宜阶段的小孢子发育成胚状体有影响，国外文献报道，在大量培养小孢子时，单核早期的小孢子对胚状体形成和发育无害，而二核晚期以后的小孢子可产生某种有毒物质抑制胚状体的产生和发育。因此，供体材料必须选取精确的花蕾大小。

初花期分别取主花序和一次分枝健康的花蕾，选择2.5～3.5㎜，即处于单核晚期-双核早期的花蕾，经次氯酸钠溶液表面消毒10～15分钟后用无菌水冲洗3次。

(2)分离小孢子：将经表面消毒过的花蕾置于50ml无菌离心管中加少量B5液体洗液用玻璃棒研磨碎，经100目双层尼龙网过滤到新的无菌离心管中，1000r/min离心3～5min，弃去上清液，再加入B5液体洗液摇匀离心，如此重复2～3次。

(3)培养：第三次离心结束后吸去B5洗液，将小孢子悬浮于NLN-13液体培养基中，分装在培养皿中(约1～2个花蕾/ml)，置于32℃恒温箱中黑暗培养2周，待肉眼见到胚形成时,放入摇床（50r/min，25℃，黑暗）继续震荡培养2周。

(4)胚状体成苗与继