禽大肠杆菌检测技术.pdf

《禽病防治技术》

禽大肠杆菌病原学检测

1目的

1.1使检测员熟悉并掌握禽大肠杆菌病原学检查鉴定。

2适用范围

2.1本实验适用于禽大肠杆菌病原学检查鉴定过程。

3试剂和仪器设备

3.1试剂和材料

解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、酒精棉、记号笔、采样单、记录

本、无菌平皿、无菌试管、口罩、乳胶手套、无菌PBs缓冲溶液、30%

甘油缓冲溶液、消毒液等。

3.2仪器设备

显微镜、微波炉、超净工作台等。

4检测步骤

4.1病料的采集

4.1.1仪器设备

4.1.2方法步骤

无菌环境下采集病死鸡肝脏、病变肠组织置于无菌平皿中；肠道

内容物装于含有无菌PBS缓冲溶液的试管中。

4.1.3结果观察

4.2染色镜检

4.2.1仪器设备

显微镜、香柏油、擦镜液、载玻片、吸水纸、革兰氏染色液。

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4.2.2方法步骤

取肝脏做组织触片，进行革兰氏染色后进行显微镜观察。

4.2.3结果观察

革兰氏阴性染色的中等大小，两端钝圆的杆菌，无芽孢，有鞭毛

和菌毛，能够运动。

4.3培养基制备

4.3.1仪器设备

天平、量筒、微波炉、pH试纸、1%NaOH溶液，普通琼脂培养基

试剂、麦康凯培养基试剂、ss培养基试剂、肉汤培养基试剂及生化

培养基试剂（葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖，MR试验、VP试验、

枸橼酸试验、硫化氢、吲哚试验）。

4.3.2方法步骤

按照以下流程进行培养基的制备。计算、称量、加热溶解、调节

pH，分装、标记、灭菌。

4.3.3结果观察

无菌检验合格后，4℃保存备用。

4.4划线分离与纯化

4.4.1仪器设备超净工作台、酒精灯、接种环、试管架、记号笔、

恒温培养箱。

4.4.2方法步骤以无菌操作的方式将病料分析划线分离接种到普

通琼脂培养基、麦康凯培养基、SS培养基和肉汤上，37℃培养24h。

将在麦康凯培养基上生长的粉红色菌落进行纯化。

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4.4.3结果观察

在普通琼脂培养基上生长出直径为1mm~3mm大小的表面湿润光

滑，呈浅灰色的透明菌落。在麦康凯培养基上生长粉红色、中间凹陷

的致病菌群落。在SS培养基生长出带有特殊金属光泽的铁黑色菌

落。肉汤均匀浑浊。

纯化后进行染色镜检，观察纯化结果。显微镜下为统一的革兰氏

阴性中等大小，两端钝圆的无芽孢杆菌，则说明纯化结果良好。

4.5细菌的生化实验

4.5.1仪器设备超净工作台、酒精灯、接种环、试管架、记号笔、

恒温培养箱。

4.5.2方法步骤

以半固体穿刺培养的方法进行糖发酵、枸橼酸及硫化氢试验；以

液体培养基接种的方法，进行MR、VP与吲哚试验。

4.5.3结果观察

发酵糖苷、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，产酸产气，不发酵蔗糖，

MR试验、VP试验、枸橼酸试验、硫化氢均为阴性，吲哚试验为阳性。

4.6动物接种

4.6.1仪器设备

注射器、SPF鸡、细菌肉汤培养物、灭菌生理盐水。

4.6.2方法步骤

选择健康的12日龄肉鸡10只，分为试验组和对照组，每组

5只鸡。试验组每只鸡胸肌注射分离菌0.4mL，对照组注射等量生理

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盐水。

4.6.3结果观察

结果试验组肉鸡注射分离菌36h后精神沉郁、不采食，排白色

粪便，病理剖检见包心、包肝，对照组肉鸡一切正常。

采集患病鸡肝脏与脾脏进行染色镜检后可见大量革兰氏阴性中

等大小，两端钝圆的无芽孢杆菌即可判断。

4.7药物敏感性实验

4.7.1仪器设备

超净工作台、酒精灯、接种环、试管架、记号笔、眼科镊子、恒

温培