高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞中四氢生物蝶呤对一氧化氮生成的影响.docxVIP

高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞中四氢生物蝶呤对一氧化氮生成的影响

一、实验背景与目的

在糖尿病肾病（DN）的发病机制中，高糖环境引发的肾脏微血管病变是核心环节之一，而大鼠肾小球系膜细胞（RMCs）的功能异常在肾小球硬化、肾功能衰退过程中扮演关键角色。一氧化氮（NO）作为重要的血管舒张因子，其正常生成对维持肾小球内环境稳定、调节肾血流量至关重要；四氢生物蝶呤（BH4）是NO合成酶（NOS）的关键辅酶，可通过维持NOS活性中心结构稳定，促进NO生理性生成，同时抑制超氧阴离子（O??）等活性氧生成，减少氧化应激损伤。

本实验旨在通过体外高糖培养RMCs，明确BH4对细胞内NO生成的调控作用，初步探讨BH4改善高糖诱导RMCs功能紊乱的分子机制，为糖尿病肾病的防治提供新的实验依据。

二、实验材料与方法

（一）实验材料

细胞株：大鼠肾小球系膜细胞株（HBZY-1），购自中国典型培养物保藏中心。

主要试剂：高糖DMEM培养基（葡萄糖浓度30mmol/L）、正常糖DMEM培养基（葡萄糖浓度5.5mmol/L）、四氢生物蝶呤（BH4，纯度≥98%）、NO检测试剂盒（硝酸还原酶法）、NOS活性检测试剂盒、MTT细胞增殖检测试剂盒、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）等。

主要仪器：CO?培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪、实时荧光定量PCR仪。

（二）实验分组与处理

将对数生长期的RMCs分为4组，每组设3个复孔，处理如下：

正常糖对照组（NG组）：采用含10%FBS的正常糖DMEM培养基培养。

高糖模型组（HG组）：采用含10%FBS的高糖DMEM培养基培养。

BH4低剂量干预组（HG+BH4-L组）：高糖培养基中加入5μmol/LBH4。

BH4高剂量干预组（HG+BH4-H组）：高糖培养基中加入20μmol/LBH4。

所有细胞均置于37℃、5%CO?培养箱中培养48h，后续进行相关指标检测。

（三）检测指标与方法

细胞活力检测：采用MTT法，将细胞接种于96孔板，培养48h后加入MTT溶液（5mg/mL），孵育4h后弃上清，加入DMSO溶解结晶，酶标仪检测490nm处吸光度（OD值），计算细胞活力（细胞活力=实验组OD值/NG组OD值×100%）。

NO生成量检测：收集各组细胞培养上清液，按照NO检测试剂盒说明书操作，酶标仪检测540nm处OD值，根据标准曲线计算NO浓度（μmol/L）。

NOS活性检测：提取细胞总蛋白，采用NOS活性检测试剂盒（比色法），检测340nm处OD值变化，计算NOS总活性（U/mgprot）及诱导型NOS（iNOS）、内皮型NOS（eNOS）活性。

eNOSmRNA表达检测：采用实时荧光定量PCR法，提取细胞总RNA并逆转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，检测eNOSmRNA相对表达量（采用2?ΔΔCt法计算）。

三、实验结果

（一）BH4对高糖培养RMCs活力的影响

与NG组相比，HG组细胞活力显著降低（P0.05）；与HG组相比，HG+BH4-L组和HG+BH4-H组细胞活力均显著升高（P0.05），且HG+BH4-H组细胞活力高于HG+BH4-L组（P0.05），表明BH4可剂量依赖性改善高糖对RMCs的毒性损伤。

（二）BH4对高糖培养RMCsNO生成量的影响

NG组NO浓度为（18.23±1.56）μmol/L；HG组NO浓度显著降至（8.95±0.92）μmol/L（P0.01）；经BH4干预后，HG+BH4-L组和HG+BH4-H组NO浓度分别升至（12.67±1.13）μmol/L和（16.32±1.35）μmol/L（均P0.01），且高剂量BH4干预效果更接近正常水平，提示BH4可促进高糖环境下RMCs的NO生成。

（三）BH4对高糖培养RMCsNOS活性的影响

总NOS活性：HG组总NOS活性显著低于NG组（P0.01）；HG+BH4-L组和HG+BH4-H组总NOS活性较HG组显著升高（P0.05或P0.01），且高剂量组活性更高（P0.05）。

eNOS与iNOS活性：与NG组相比，HG组eNOS活性显著降低（P0.01），iNOS活性无显著变化（P0.05）；BH4干预后，eNOS活性随BH4剂量增加而升高（HG+BH4-H组vsHG组，P0.01），iNOS活性仍无显著差异（P0.05），