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酵母双杂交技术

CATALOGUE

目录

01

技术概述

02

原理机制

03

实验流程

04

数据分析

05

应用领域

06

优势与局限

01

技术概述

基本定义与背景

分子互作检测技术

酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid,Y2H）是一种基于转录激活的体内分子互作检测技术，通过将目标蛋白分别与DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）融合，若两蛋白发生相互作用，则激活报告基因表达。

理论基础

技术优势

源于对真核生物转录因子模块化结构的理解，1989年由Fields和Song首次提出，利用酵母细胞作为宿主系统，模拟蛋白质间的天然互作环境。

具有高通量、低成本、可直接在活细胞中检测互作的特点，适用于大规模蛋白质相互作用网络的构建。

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核心发展历程

第一代系统开发

1990年代初基于GAL4转录因子的BD-AD分离体系，推动了蛋白质互作研究的标准化，但存在假阳性和假阴性率较高的问题。

系统优化阶段

2000年后引入LexA-VP16等替代系统，通过改进报告基因（如HIS3、LacZ）和宿主菌株（如AH109、Y187），显著提升灵敏度和特异性。

衍生技术扩展

发展出反向双杂交、膜酵母双杂交（Split-Ubiquitin）等技术，扩展了膜蛋白、毒性蛋白等特殊蛋白的检测能力。

主要应用场景

蛋白质互作网络图谱构建

广泛应用于基因组尺度筛选，如人类蛋白质组计划（HuRI）中超过50%的数据来源于Y2H技术。

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01

病原体-宿主互作研究

在病毒学领域用于鉴定病毒蛋白与宿主细胞因子的相互作用界面，为抗病毒治疗提供靶点。

药物靶点验证

通过检测小分子化合物对关键蛋白互作的干扰效应，用于药物作用机制研究和先导化合物筛选。

遗传疾病机制解析

通过检测致病突变对蛋白质互作的影响，揭示如癌症相关信号通路异常等分子病理机制。

02

原理机制

蛋白质相互作用依赖于特定结构域（如SH3、PDZ等）与靶蛋白的特异性结合，这种结合通常由氨基酸序列和空间构象决定，具有高度专一性。

蛋白质相互作用基础

蛋白质结合域与靶蛋白识别

氢键、疏水作用、范德华力等非共价键是维持蛋白质复合物稳定性的关键，其强度与结合亲和力直接影响双杂交信号的检测灵敏度。

非共价键作用力

蛋白质相互作用可受磷酸化、泛素化等翻译后修饰调控，这些修饰可能改变结合位点的可及性或亲和力，从而影响酵母双杂交实验结果。

动态相互作用调控

酵母双杂交系统构成

将待测蛋白X与DNA结合域（如GAL4-BD）融合，蛋白Y与转录激活域（如GAL4-AD）融合，两者相互作用可重构转录因子功能。

融合蛋白构建

酵母宿主选择

载体系统设计

常用酿酒酵母菌株（如AH109、Y2HGold）具有特定的营养缺陷型标记（如His3、Ade2），用于筛选阳性互作。

包含多克隆位点、核定位信号及选择性标记（如氨苄抗性基因），确保外源蛋白在酵母中正确表达和定位。

报告基因工作机制

背景抑制策略

使用3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）抑制内源性HIS3表达，通过调整抑制剂浓度优化信噪比，提高弱互作的检测能力。

转录级联放大

激活域招募RNA聚合酶Ⅱ及通用转录因子，启动报告基因转录，单个相互作用事件可产生大量酶分子，实现信号放大。

双报告基因验证

典型系统采用HIS3（组氨酸合成酶）和LacZ（β-半乳糖苷酶）基因，通过营养缺陷补偿和显色反应双重验证互作，降低假阳性率。

03

实验流程

融合蛋白设计方案

选择合适载体系统

根据研究目的选择pGBKT7（DNA结合域载体）或pGADT7（激活域载体），确保目标蛋白正确融合到GAL4转录因子的BD或AD结构域上。

设计引物与克隆策略

针对目标基因设计含酶切位点的特异性引物，通过PCR扩增后克隆至载体，需验证读码框正确性以避免移码突变。

考虑蛋白互作结构域

分析目标蛋白的功能域，优先保留已知互作区域，避免因全长蛋白表达导致酵母毒性或自激活现象。

添加核定位信号

对于胞质蛋白需在融合蛋白中加入SV40NLS序列，确保蛋白能进入细胞核激活报告基因表达。

制备感受态酵母细胞

共转化质粒组合

使用PEG/LiAc法处理AH109或Y187菌株，提高细胞膜通透性，转化效率需达到10^5cfu/μgDNA以上。

将BD-诱饵蛋白和AD-猎物蛋白载体按1:3比例混合转化，同时设置空载体对照以排除自激活干扰。

酵母细胞转化步骤

热激与复苏条件优化

42℃水浴热激15分钟后，30℃复苏培养3-4小时，使用SD/-Leu/-Trp双缺培养基进行初始筛选。

转化效率验证

通过稀释涂板计数转化子数量，确保每组实验获得足够克隆（建议100个）用于后续分析。

阳性克隆筛选策略

依次使用SD/-Leu/-Trp（双缺）、SD/-Ade/-His/-Leu