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抑菌活性实验方案

薄层层析(TLC)是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪类、糖脂和

生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。

(1)初始发酵培养基的筛选

在250mL三角瓶装100mL基础培养，将种子培养基以6%接种量接入各种

基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170r/min培养5d，测

定不同培养基下发酵液对供试病原菌的抑制率，确定最佳基础培养基。

(2)发酵时间的确定

将活化的种子培养基以6%接种量接入筛选出的基础培养基中，细菌37℃

160r/min培养1d，放线菌28℃、170r/min培养不同时间段，测定每个时间段发

酵液上清液对供试病原菌的抑制率，确定最佳发酵时间。

(3)发酵初始pH值的初步确定

将优化后碳氮源的基础培养基的pH分别调成3、5、7、9、11，然后再按6%接

种种子培养基，28℃、170r/min培养一定时间后，测定不同pH培养基发酵液

无菌滤液对供试病原菌的抑制率，确定初始pH范围。

(4)发酵温度的初步确定

以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按6%接种种子培养基，分别在

20℃、24℃、28℃、32℃、36℃，170r/min培养一定时间后，测定不同温

度下发酵所得发酵液对供试病原菌的抑制率，确定发酵温度范围。

(5)发酵接种量的初步确定

以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，分别按2%、4%、6%、8%、10%

接种种子培养基，在28℃、170r/min培养一定时间后，测定不同接种量对发酵

液抑菌活性的影响，确定发酵接种量范围。

(6)发酵转速的初步确定

以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按6%接种种子培养基，28℃、

以100r/min、130r/min、160r/min、190r/min、210r/min培养一定时间后，测定

不同发酵转速对发酵液抑菌活性的影响。

(7)发酵装液量的初步确定

以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，在250mL锥形瓶中装入50mL、

75mL、100mL、125mL、150mL，按6%接种种子培养基，28℃、170r/min

培养一定时间后，测定不同发酵装液量对发酵液抑菌活性的影响。

(8)碳、氮源的筛选

碳源优化：分别以葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、小米、玉米粉、麦芽

糖、燕麦粉和麸皮替换筛选出基础培养基中的碳源，并以缺少碳源的基础培养基

为对照；以初始发酵条件进行发酵，测定不同碳源发酵液上清液对供试病原菌的

抑制率，确定最佳碳源。

氮源优化：分别以豆饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、

尿素、牛肉膏和黄豆粉替换筛选出基础培养基中的氮源，并以缺少氮源的基础培

养基为对照；发酵条件同碳源优化，测定不同氮源发酵液对供试病原菌的抑制率，

确定最佳氮源。

(9)碳源浓度的初步确定

筛选出的氮源浓度不变，将碳源浓度设置5个浓度梯度，以初始发酵条件进

行发酵，测定不同C源浓度发酵液对供试病原菌的抑制率，确定碳源浓度范围。

(10)氮源浓度的初步确定

筛选出的碳源浓度不变，将氮源浓度设置5个浓度梯度，以初始发酵条件进

行发酵，测定不同N源浓度发酵液对供试病原菌的抑制率，确定氮源浓度范围。

3.活性成分分析

薄层层析法

（1）挥发油的检查

首先观察滤纸上有无油迹样斑点，加热烘烤时若油迹消失，证明有挥发油，若未

消失，需用试管法进一步确证。为进一步检查，可用石油醚:乙酸乙酯(95:5)展开

提取液，喷以新配制5%香荚兰醛的浓硫酸溶液，如在斑点上出黄色、棕色、红

色或兰色反应，表明含有挥发油。

（2）生物碱检查

显色剂：改良碘化铋钾试剂：橙色、棕红色斑点为正反应。

（3）强心甙检查

显色剂：先喷以2%3,5-二甲基苯甲酸乙醇溶液，再喷以4%NaOH乙醇溶液，

紫红色斑点，反应后，荧光显著加强为正反应。

（4）黄酮及甙类检查

a、先在紫外灯下观察荧光，再喷以1%AlCl3溶液观察荧光是否加强，如原显