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鉴定红曲菌中蔡醍响应基因提高红曲色素产率

红曲色素是由红曲菌(也称红曲霉)(Monascusspp.)合成的一类次级代谢产物作为天然食用色素,在我国以及东南亚地区使用至今已有1000多年历史［3］。近年来，红曲色素以其着色自然、健康无毒以及色调温和等特点，成为国内销量较高的天然食用色素之一,并出口到欧美等兴旺国家［4］。

目前红曲色素生产菌株的产率仍不能完全满足工业生产需要。因此，提高红曲菌产率仍是本领域中的核心课题［5-6］。前期研究发现,蔡醒化合物能够促进红曲菌合成红曲色素［7］,如果能够找到红曲菌中响应蔡醍化合物的基因，将有可能利用蔡醒化合物提高红曲色素产率。然而，目前红曲菌的蔡醒响应基因仍未见报道［7］。

随着转录组学与人工智能的开展，已有报道可以借助这2种工具来挖掘目标基因［8-9］。人工智能是一种利用不同计算机算法来进行数据学习，得到描述生物等过程模型的预测方法［10］。近年来开展起来的人工神经网络(artificialneuralnetwork,ANN)模型，能够较为精确地描绘微生物中基因与表型之间的内在关系，用于挖掘参与特定株M7和过表达菌株M7：：PtrpC-mga2中mga2基因的转录表水平，发现过表达菌株中该基因的转录水平是野生菌株的4.2倍（图4-d）o综合以上结果说明提高mga2基因的表达量能够增强红曲菌对蔡醒的响应能力。最后，研究还测定了红曲色素发酵的过程曲线，可见白花丹醍诱导后红曲色素产率显著增加（图4-e）。

a-不同蔡醍对菌株M7：：PtrpC-mga2红曲色素产率的影响；b-不同浓度白花丹醛对菌株M7：：PtrpC-mga2红曲色素产率的影响；c-不同诱导时机对菌株M7：：PtrpC-mga2红曲色素产率的影响；d-原始菌株与M7：：PtrpC-mga2菌株中mga2基因的相对表达水平；e-原始菌株与M7：：PtrpC-mga2菌株发酵红曲色素的过程曲线图4白花丹醍诱导提高M7：：PtrpC-mga2菌株的红曲色素产率

Fig.4ImprovementofMonascuspigmentsyieldinstrainM7：：PtrpC-mga2byplumbagininduction3结论

本研究发现蔡能化合物能够提高红曲色素产率，然后通过转录组学和人工智能模型联用的方法预测到可能的蔡醒响应基因，利用基因工程菌株验证后，成功用于提高红曲色素产率。研究发现,G蛋白中的B亚基mga2是红曲菌中的蔡醛响应基因，利用该基因的过表达菌株,在白花丹醍诱导下红曲色素产率显著提高。本研究不仅率先发现红曲菌中的蔡醒响应基因，并应用于提高红曲色素产率，也为其他真菌中相似研究提供了方法上的借鉴。

生物过程的关键基因［8-10］。

本研究首先利用转录组方法初步筛选了M.ruberM7菌株中参与禁醍响应的基因，然后选择并优化得到ANN模型，借此预测出2个可能性最高的恭配响应基因，利用基因敲除菌株验证mga2基因是蔡醒响应基因，以期利用白花丹醍诱导mga2基因过表达菌株获得较高的红曲色素产率。

1材料与方法1材料与试剂

MonascusruberM7(CCAM070120,CultureCollectionofStateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology)为本实验保存。红曲菌基因敲除菌株AlaeA.AnirpigB和△mga2,以及mga2基因过表达菌株M7：：PtrpC-mga2为本课题组前期构建并保存。蔡醍类化合物1,4-蔡醒、甲蔡配、1,2-蔡配、白花丹配、5-羟基-1,4-蔡配与拉帕醇，上海阿拉丁试剂。

仪器与设备

UV-1700型分光光度计，日本Shimadzu公司；LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司。

实验方法1.3.IM.ruberM7的生物量测定将M.ruberM7接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose

agar,PDA）斜面培养基上，在28C条件下培养10d,用无菌水洗涤斜面菌丝上的匏子，得到5X105抱子/mL的袍子液。将5mL抱子液接种到50mL马铃薯葡萄糖肉汤（potatodextrosebroth,PDB）培养基中，在28℃,120r/min的条件下培养。发酵第12天时，离心（5000r/min）别离菌丝体和发酵液，冷冻干燥后称量菌丝体干质量。

蔡醛化合物诱导发酵实验将恭醒化合物预先溶解于二甲基亚飒

（dimethylsulfoxide,DMSO）o在液态发酵第5天时，将蔡配溶液加入发酵液中，继续培养。

红曲色素的测定取冷冻干燥的菌丝体0.