细菌内毒素检测技术与应用讲课文档.pptVIP

细菌内毒素检测技术与应用;1、热原

--热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质。

--Webster将热原定义为“致热剂”。

;1)早期的热原研究

–静脉疗法的研究与热原的研究密切相关

–在18,19世纪有很多关于静脉疗法的报道,所有病人在注射后都伴随有发热反应,当时的医生都深信发热对人体有益

–1912年,Hort和Penfold阐明注射发热的真正本质,将细菌分为热原和非热原两种:

A、革兰氏阴性细菌为热原细菌

B、革兰氏阳性细菌为非热原细菌

–他们推断出所有的注射发热都是由革兰氏阴性细菌产生的可滤过的,热稳定的物质导致的

;2)热原的检测

–1941年,美国USP,FDA和NIH(美国国家卫生研究所)邀请了14个制药厂商参与第一次热原的协作研究。

–1942年,美国药典第一次收载热原检查法

该方法是将一定量的供试品通过静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况来判定供试品中所含热原量是否符合规定。

3)细菌内毒素检查(BET)

–利用鲎试剂来检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素,用以判断供试品中细菌内毒素含量是否符合规定

;2、历史回顾——鲎试剂与细菌内毒素检查

1)国际

–1956年,美国科学家FredericBang发表论文《鲎的一种细菌性疾病》,阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象.随后,Bang和Levin发明了鲎试剂。

–1980年,FDA发表使用鲎试剂检查人用和兽用注射药终成品内毒素的准则;美国药典20版(USPXX)收载BET法。

–1989年英国药典收载BET法–1991年日本药局方收载BET法。

;–1999年,USPXXIV版规定670种药品用BET法检查,保留热原检查的药品约20种。

–2000年,国际调和委员会使USP,EP和JP达成《BET的国际调和案》,统一的BET法收载于USPXXIV版NF19的第二增补本中,并于2001年1月1日生效

;2)国内

–1983年,由11个单位参加的卫生部鲎试剂研究协作组的成立。

–1988年,卫生部颁布《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标准

–1991年,卫生部部颁标准规定4种药品可使用细菌内毒素检查法。

–1993年,中国药典(CP)九零版第二增补本收载BET法。

–1995年版CP规定13个品种使用BET法。

;–2000年,CP2000版细菌内毒素检查品种增至69种;附录《细菌内毒素检查法应用指导原则》中收录了BET定量法。

–2005年,CP2005版细菌内毒素检查品种增至168种;BET法正式收载光度测定法。

;3、BET发展趋势与特

1)BET技术的发展趋势

(1)细菌内毒素检查取代热原检查

-BET法所具有的优点:快速,灵敏,可标准化等

(2)走向统一的BET法

-WHO实现了内毒素的国际标准品(IS)的效价(IU)与各国内毒素标准品的效价(EU)的统一,即1IU=1EU。

;2)BET技术及应用发展的特点

(1)BET方法呈多样化

–凝胶法–比浊法-动态比浊法-终点比浊法

–比色法-动态比色法-终点比色法

(2)BET趋向自动化

–凝胶法恒温设备方面,干式恒温仪器逐步取代水浴恒温箱

–定量BET试管式定量检测仪酶标板式定量检测仪全自动的BET系统专用的数据软件

;3)BET试剂的发展

–鲎试剂的灵敏度越来越高

凝胶法最高达0.0075EU/ml,商品试剂0.015EU/ml定量法高达0.001EU/ml

4)BET应用的领域越来越广

–药品检验

–药品生产过程质控

–临床应用:辅助诊断

–其它领域:食品卫生,环境保护

;二、细菌内毒素的理论基础;1、细菌内毒素

1)化学成分及特性

–革兰氏阴性细菌细胞壁的产物

–是高分子量脂多糖复合物(LPS)

单体分子量介于10,000至20,000道尔顿典型地以100,000至500,000道尔顿的聚合体形式存在

;(1)特性

-致热性：内毒素作用于人体细胞,使之释放内原性热原,再刺激下丘脑体温调节中枢,引起发热反应。

-耐热性：需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活。

-分子极性：多糖链有亲水性,脂肪链具有疏水性,在水中呈不均匀分布。

-酸碱性：与强酸强碱水解反应。

-鲎反应性：能与鲎试剂发生多级酶促反应,形成凝胶。除上述性质外,LPS还有许多其它的生物活性