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苹果抗轮纹病相关基因4CL、COMT、EDS1、EDS2的克隆与遗传转化研究

一、引言

1.1研究背景与意义

苹果作为世界上广泛种植且深受消费者喜爱的水果之一，在全球水果产业中占据着重要地位。我国是苹果栽植大国，产量长期位居世界首位。然而，苹果产业的发展面临着诸多挑战，其中苹果轮纹病的危害尤为突出。苹果轮纹病是一种由葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）引起的严重病害，主要危害苹果的枝干和果实。在枝干上，病斑以皮孔为中心，形成扁圆形或椭圆形的红褐色病斑，质地坚硬，中心突起，边缘龟裂，后期病组织翘起如马鞍状，导致枝干表面粗糙，故有“粗皮病”之称。果实受害时，初期以皮孔为中心出现水渍状褐色小斑点，随后病斑迅速扩大，形成黑褐色的同心轮纹状，果肉软腐，严重影响果实的品质和产量。

苹果轮纹病在我国各苹果产区广泛分布，由于我国主栽品种富士对轮纹病高度易感，使得该病的发生更为严重。据统计，在一些重病果园，果实的发病率可高达50%以上，甚至造成绝收，给果农带来了巨大的经济损失。传统的防治方法主要依赖于化学药剂，如有机硫杀菌剂、杂环类、苯并咪唑类、三唑类等。然而，长期大量使用化学药剂不仅导致病菌产生抗药性，使防治效果逐年下降，还造成了环境污染和食品安全问题。此外，果园管理措施不当，如清园不彻底、施肥不合理、树势衰弱等，也加剧了苹果轮纹病的发生和传播。

培育抗病品种是解决苹果轮纹病危害的根本途径。通过克隆苹果抗轮纹病相关基因，并将其导入感病品种中，有望培育出具有高抗轮纹病能力的新品种。在植物的抗病机制中，4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）和咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）参与木质素的合成，木质素是植物细胞壁的重要组成成分，其含量的增加可以增强细胞壁的机械强度，阻碍病菌的侵入和扩展。增强型疾病易感性1（EDS1）和增强型疾病易感性2（EDS2）则在植物的防御信号传导途径中发挥关键作用，它们可以激活植物的一系列防御反应，如产生植保素、诱导病程相关蛋白的表达等，从而提高植物的抗病能力。因此，深入研究这些基因的功能和作用机制，对于揭示苹果抗轮纹病的分子机制具有重要意义。通过基因工程技术将这些抗病基因导入苹果品种中，为培育抗病新品种提供了新的技术手段，有望从根本上解决苹果轮纹病的危害问题，推动苹果产业的可持续发展。

1.2国内外研究现状

国内外学者针对苹果抗轮纹病进行了大量研究。在病原菌方面，明确了葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）是引起苹果轮纹病的主要病原菌，并对其生物学特性、侵染规律进行了深入探究。研究发现，病菌以菌丝体、分生孢子器及子囊壳在被害枝干上越冬，次年春季通过风雨传播，从皮孔或伤口侵入寄主，在果实上具有潜伏侵染特性，幼果期侵染后，近成熟期和贮藏期才显症状。

在寄主抗病机制研究上，已取得一定进展。山东农业大学陈学森教授与吴树敬教授团队分离得到苹果突触融合蛋白基因MdSYP121，发现沉默该基因可增强转基因苹果愈伤组织对苹果轮纹病菌侵染的耐受性，其作用与水杨酸（SA）合成及信号相关基因的转录有关。南京农业大学渠慎春教授团队报道了野生苹果种质湖北海棠通过跨界传递miRNA诱导葡萄座腔菌基因沉默的轮纹病防御途径，发现湖北海棠miR159a能够通过外泌体传递到入侵真菌中，靶向葡萄座腔菌糖转运基因STP，从而调控苹果对轮纹病的抗性。青岛农业大学柏素花教授课题组发现液泡加工酶MdVPE4与半胱氨酸蛋白酶抑制剂MdCPI1互作参与苹果轮纹病抗性调控，MdVPE4正调控苹果果实轮纹病抗性，MdCPI1也正调控苹果轮纹病抗性。

尽管已有诸多成果，但目前研究仍存在一定空白与不足。对于一些关键抗病基因，如4CL、COMT、EDS1、EDS2等，其在苹果抗轮纹病过程中的具体作用机制尚未完全明晰。不同基因之间的相互作用关系以及它们如何协同调控苹果的抗病反应，还需要进一步深入研究。在抗病基因的遗传转化应用方面，虽然取得了一些进展，但转化效率和稳定性仍有待提高，且转化后的转基因植株在田间的抗病表现和生态安全性评估还不够全面。

1.3研究目标与内容

本研究旨在克隆苹果抗轮纹病相关基因4CL、COMT、EDS1、EDS2，并对其进行遗传转化，为培育抗轮纹病苹果新品种奠定基础。具体研究内容如下：

苹果抗轮纹病相关基因的克隆：以苹果品种“鸡冠”和“富士”的杂交后代中选择的抗病株系“1-1-46”和感病株系“1-1-40”的叶片为试材，接种苹果轮纹病菌（Botryosphaeriadothidea）后，提取总RNA，反转录成cDNA。根据已报道的苹果4CL、COMT、EDS1、EDS2基因序列设计特异性引物，利用PCR