美国病理学会对于二代测序临床诊断的实验室标准.docxVIP

美国病理学会(CAP)对于二代测序临床诊断的实验

室标准

相对于桑格测序来说，二代测序的较高的通量和每个碱基所消耗较低的本钱，使得其快速应用于临床检测领域。尽管在1988年美国病理学会(CAP)没有给出这项技术在临床诊断上的实验室标准标准。但在过去的几年，能够提供二代测序检测效劳的实验室相应的不断增加。

目的：针对应用二代测序技术的临床诊断给出一个检查清单用以标准化实验操作平台和生物信息数据分析平台。因为基于NGS的临床检测是一个新的诊断技术，而且相对于一代测序其更为复杂，所以目前亟需针对这些检测制定新的标准标准。

设计：针对NGS制定必要的规章制度，促进这项技术更好地应用于临床检测。在2011年CAP成立了NGS工作组委员会，以对检测清单的工程内容进展仔细研究。

结果：在CAP分子病理学检测清单中总共包含针对实验操作平台和生物信息数据分析平台的18项实验室认证要求清单。

结论：这项经CAP委员会认真考虑后所给的报告陈述了对于制定新的检测清单的重要性。其中包含文件、批准、质保、验证、异常日志、监控升级、各个版本解释及报告、附带的发现、数据储藏、可追溯性模板、数据传送保密性等的处理。

DNA测序即二代测序技术(NGS)由七十年代的化学测序法和桑格测序法逐渐演化而来。NGS与一代测序主要的不同是其可以并行的对数以百万的DNA短片段同时测序而非仅有一种DNA片段。在九十年代中期基于荧光毛细管凝胶电泳的自动化桑格测序的产生使得DNA测序普遍应用于临床诊断。而NGS更高的通量远远超过自动化桑格测序。二代测序的较高的通量和每个碱基所消耗较低的本钱，使得其快速应用于临床检测领域，尽管NGS各方面分析都更为复杂。包括数据获得和储藏的案例远超出于1988年临床检验科改善后的实验室修正案，对于后续数据计算具有较大挑战性。NGS检测的领域涉及遗传病、实体瘤、恶性血液病、传染性疾病，人类白细胞抗原分析，非侵害性产前诊断，胎儿染色体异常检测。

安装，在发布的个体的生物信息学工具或运行算法方面，利用可替换的配置参数定制路径。无论哪种情况，实验室必须以文件形式记录所有的与默认设置不同的自定义内容或者明确指明所用到的参数、路径、数值等。大局部的生物信息分析通过与参考序列进展比对，参考序列的版本号及组装的详细信息都需要明确指出。当描述生物信息路径时，实验室应该以文件的形式记录所有的数据分析，包括每一步输入和输出的文件。对于每一步的正常表现，实验室应该也制定和记录质控参数。例如，首要步骤，一个实验室会决定采纳一套标准，如特定仪器质量过滤后，通过的可读序列数量。变异位点识别的标准是必不可少的，用到的参数阈值包含测序深度，变异位点质量评分，等位基因读取比率。在后期数据筛选的流程和依据也需要表达在SOP文件中。

NGS生物信息分析流程验证

实验室对生物信息分析的验证生效以及当有变动时对整个分析流程或流程的一局部性能进展从新验证生效。从新认证的程度范围由修改变动内容而定。正如实验流程一样，在确立一个包含序列分析可读文件的生物信息分析流程时，实验室会经历一个自身不断修正的过程。对于能够完成从测序实验到生物信息分析的整个流程的实验室，生物信息分析路径的验证生效应该包含整体的验证。一旦实验室形成并经历性确实定了最正确操作，并对流程完成了充足的检测，下一步就是再利用含有变异位点的样品产生的序列执行并文件化，进展全面的验证。对于内部研发的软件工具或供给商提供的已经锁定的软件工具（如对根底工具没有进展任何修改），这些步骤是必不可少的。对于实验测序平台，需要对充足的样品数量进展分析?，去评价其诊断分析的灵敏性，特异性和重复性。样本数量的评估应由实验本身决定。一些参数如基因数量的评估，基因区域的评估，以及需要检测的变异类型最终都应确认控制的数量，良好的特征样品（例如人类基因组单体型图样本或的固有的细胞系或设计的变异），或之前诊断过的样品。众所周知，假基因以及与靶序列高度同源的序列的出现对与准确的序列图谱映射，序列比对，及相关的变异识别都有干扰。在一个给定的临床诊断实验中，需要对干扰的程度进展判定。尽管在生物信息分析上高度同源序列的设置调整的挑战，可能会解决掉，但是实验室仍需要设置一个独立的可替代性分析方法去应对这一领域的问题。NGS工作组认为全面详尽的定义假阳性和假阴性对应的错误率是不可行的。然而实验室应该在变异类型上对典型的实例的错误率进展评估。通过对照样品、特征样品可以对这些错误率进展评估。假阳性的错误率可以通过可替代性的测序方法进展确定。假阴性的错误率很难确定，因为其起源于多种情况，包括在给定靶区域内测序深度的缺乏，变异的识别的缺少可能因为质量评分设置较低，序列读取的方向分布