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毕赤酵母中猪β防御素2与猪γ干扰素融合表达及活性特征解析

一、引言

1.1研究背景与意义

养猪业在我国农业经济中占据重要地位，是农民增收和保障肉类供应的关键产业。然而，猪病的频繁发生给养猪业带来了巨大的经济损失。据统计，每年因猪病导致的直接经济损失高达数十亿元，严重制约了养猪业的健康发展。猪病不仅影响猪的生长发育和繁殖性能，导致猪只死亡率上升，还会降低猪肉的品质和安全性，对食品安全构成潜在威胁。因此，猪病的防治对于保障养猪业的可持续发展、维护食品安全和社会稳定具有至关重要的意义。

猪β防御素2（PBD-2）和猪γ干扰素（PoIFNγ）作为猪体内重要的免疫调节因子，在抵抗病原体入侵和调节免疫反应中发挥着关键作用。PBD-2是一种阳离子抗菌肽，具有广谱的抗菌、抗病毒和免疫调节活性。研究表明，PBD-2能够抑制多种细菌和病毒的生长，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒等。其作用机制主要包括破坏病原体的细胞膜结构、干扰病原体的代谢过程以及调节免疫细胞的活性等。PoIFNγ是一种由活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的细胞因子，具有强大的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。PoIFNγ可以诱导细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒的复制和传播；同时，它还能够增强免疫细胞的活性，促进免疫细胞的增殖和分化，提高机体的免疫应答水平。

将PBD-2和PoIFNγ进行融合表达，有望获得具有双重功能的融合蛋白，进一步增强其在猪病防治中的效果。融合蛋白可能兼具PBD-2的抗菌、抗病毒活性和PoIFNγ的免疫调节作用，能够更全面地抵抗病原体的入侵，提高猪的免疫力。这种融合蛋白的研究对于开发新型的猪病防治药物具有重要的理论意义和实际应用价值。通过基因工程技术制备融合蛋白，不仅可以提高其产量和纯度，还能够对其结构和功能进行优化，为猪病的防治提供更有效的手段。

1.2国内外研究现状

在猪β防御素2的研究方面，国内外学者已经取得了一定的进展。研究发现，PBD-2在猪的多种组织中广泛表达，如肝脏、肠道、肺脏和骨髓等。其表达水平受到病原体感染、炎症刺激等因素的调控。在抗菌活性方面，PBD-2对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等常见革兰氏阴性菌和阳性菌的生长有明显抑制作用。在抗病毒方面，PBD-2能够抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在MA-104细胞中的增殖。Peng等人通过测定经酵母表达的rPBD2对金黄色葡萄球菌、猪链球菌和霍乱链球菌等九种微生物菌株（包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌和酵母菌）的MIC，发现rPBD2具有广泛的抗菌谱。此外，PBD-2作为饲料添加剂，还具有促生长和降低仔猪腹泻的效果。

关于猪γ干扰素的研究，也有众多成果。猪γ干扰素基因已被成功克隆和表达，其表达产物具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性。黄忠等人采用RT-PCR从猪外周血液淋巴细胞中克隆出猪γ-干扰素基因cDNA，构建了重组酵母表达载体（pPICZα-PoIFN-γ），并在巴斯德毕赤酵母X33株中实现了高效分泌表达，经SDS和Western-lot证实猪γ-干扰素分子量为18kD，细胞培养试验结果表明，重组猪γ-干扰素能抑制水泡性口炎病毒（VSV）对猪肾传代细胞（PK-15）的攻击；在动物试验中，重组猪γ-干扰素可明显提高猪伪狂犬疫苗的免疫效果。

在融合表达方面，虽然有一些相关研究，但针对猪β防御素2与猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达研究还相对较少。目前的研究主要集中在融合蛋白的表达条件优化、活性检测等方面。部分研究发现，融合蛋白的活性受到多种因素的影响，如融合方式、表达系统、蛋白折叠等。

现有研究仍存在一些不足之处。对于融合蛋白的作用机制研究还不够深入，需要进一步探究融合蛋白在猪体内的免疫调节途径和抗病毒、抗菌机制。在融合蛋白的表达和纯化方面，还需要优化工艺，提高融合蛋白的产量和纯度，降低生产成本，以满足实际应用的需求。

1.3研究目的与内容

本研究旨在通过重叠延伸PCR法合成猪β防御素2与猪γ干扰素的嵌合编码序列PBD-2-PoIFNγ，并将其克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαA，构建重组表达质粒pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ，同时构建pPICZαA-PoIFNγ重组表达质粒作为对照。通过电击转化将重组质粒导入巴斯德毕赤酵母X33，筛选阳性重组子并进行诱导表达，分析融合蛋白PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ的表达情况，检测其抑菌和抗病毒活性，比较两者的生物学活性差异，为猪病防治的新型药物研发提供理论依据和实验基础。具体研究内容如下：

采用重叠延伸PCR法合成嵌合编码序列PBD-