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基于rpoB基因的PCR-RFLP技术：非结核分枝杆菌菌种鉴定的新突破

一、引言

1.1研究背景与意义

非结核分枝杆菌（NontuberculousMycobacteria，NTM）是指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的一大类分枝杆菌的总称，广泛存在于土壤、水、灰尘等自然环境中。随着检测技术的不断发展以及免疫抑制人群的增多，NTM感染的发病率呈逐渐上升趋势，其所致疾病的临床表现与结核病相似，如肺部感染可出现咳嗽、咳痰、咯血、低热、乏力等症状，还可侵犯皮肤、淋巴结、骨骼等肺外组织，导致皮肤溃疡、淋巴结肿大、骨髓炎等疾病，严重影响患者的身体健康和生活质量。

不同种类的NTM对抗生素的敏感性存在差异，例如脓肿分枝杆菌对多种常用抗结核药物天然耐药，而鸟-胞内分枝杆菌复合群对一些药物的敏感性也与其他菌种不同。准确鉴定NTM的菌种，对于临床医生合理选择抗菌药物、制定个性化的治疗方案至关重要。如在治疗NTM肺病时，根据菌种鉴定结果选用合适的药物组合，可显著提高治疗效果，减少不必要的药物使用，降低药物不良反应的发生风险。同时，对于传染病的防控而言，明确NTM的菌种分布和流行特征，有助于及时发现传染源，采取有效的防控措施，防止疫情的扩散。因此，建立一种快速、准确、可靠的NTM菌种鉴定方法具有重要的临床意义和公共卫生意义。

rpoB基因编码RNA聚合酶β亚基，在细菌系统发育分类和鉴定上起着重要作用。其在非结核分枝杆菌中高度保守，同时又含有足够的生物遗传信息，种间存在一定程度的序列差异，可将菌种鉴定至属及种水平，为NTM菌种鉴定提供了一个理想的靶基因。基于rpoB基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法，结合了PCR技术的高效扩增能力和RFLP技术的多态性分析能力，通过扩增rpoB基因片段并使用限制性内切酶切割，根据酶切片段的长度多态性来鉴定NTM菌种，具有快速、灵敏、准确等潜在优势，在NTM菌种鉴定领域展现出良好的应用前景，有望成为临床诊断和流行病学调查的有力工具。

1.2国内外研究现状

在国外，NTM鉴定方法的研究起步较早。传统的鉴定方法如抗酸染色、培养、PNB生长实验等，虽然操作相对简单、试剂价格合理且易于推广，但存在耗时长、阳性率低、污染大且缺乏可重复性等问题，不能及时、准确地为临床诊断提供参考。随着分子生物学技术的飞速发展，DNA测序技术成为鉴定菌种的“主流技术”。16S核糖体DNA（16SrDNA）作为细菌DNA序列，可用于菌种鉴定，能将细菌鉴定至种甚至亚种水平，但某些分枝杆菌同源DNA序列一致性高、亲缘性接近，导致无法区分菌种。核糖体蛋白S1（rpsA）基因、转录间区序列1（ITS-1）、热休克蛋白65（hsp65）基因等也被用于NTM菌种鉴定，各有其优势和局限性。

基于rpoB基因的PCR-RFLP技术在国外也有相关研究。有研究利用该技术对不同的NTM菌株进行分析，发现其能够鉴别16SrDNA无法鉴别的一些菌种或菌株，如堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、苏加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌等。然而，目前该技术在应用中仍存在一些问题，例如基因数据库不完善，不同研究中选用的限制性内切酶种类和组合不同，缺乏统一的标准，导致结果难以比较和推广。

在国内，NTM感染的研究也日益受到重视。传统鉴定方法仍在临床广泛应用，但逐渐意识到其不足，开始积极探索分子生物学鉴定方法。对于基于rpoB基因的PCR-RFLP技术，已有部分学者进行了相关研究。如通过对临床分离的NTM菌株进行rpoB基因PCR-RFLP分析，初步建立了该技术在本地的应用方法，但在方法的优化、准确性验证以及大规模临床应用等方面还有待进一步深入研究。同时，国内在NTM菌种鉴定的标准化和规范化方面也需要进一步加强，以提高鉴定结果的可靠性和可比性。

总体而言，当前基于rpoB基因的PCR-RFLP技术在NTM菌种鉴定方面虽取得了一定进展，但仍存在诸多不足和空白。例如，对于不同地区、不同来源的NTM菌株，该技术的适用性和准确性需要进一步验证；如何选择最佳的限制性内切酶组合，以提高鉴定的分辨率和准确性，还需要更多的研究和实践；此外，将该技术与其他鉴定方法进行综合比较和联合应用的研究也相对较少。

1.3研究目的与创新点

本研究旨在建立并优化一种基于rpoB基因的PCR-RFLP技术，用于非结核分枝杆菌的菌种鉴定，为临床病原菌诊断和流行病学调查提供准确、可靠的方法。具体而言，通过收集不同来源的分枝杆菌菌株，对其rpoB基因进行扩增、酶切及电泳分析，建立该技术的操作流程和鉴