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绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达与分子改造研究

一、引言

1.1研究背景与意义

随着全球经济的快速发展，能源需求不断攀升，传统化石能源的日益枯竭以及其使用带来的环境污染问题，促使人们迫切寻求可再生、清洁的新型能源。燃料乙醇作为一种重要的生物燃料，具有可再生、低污染等优点，被视为替代传统化石燃料的理想选择之一。纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源，每年通过光合作用产生的纤维素类物质高达1500亿吨以上，其主要来源于植物细胞壁，如农作物秸秆、木材、草类等。以纤维素为原料生产燃料乙醇，不仅可以解决能源危机和环境污染问题，还能有效利用丰富的生物质资源，避免与粮食争地的矛盾，具有重要的战略意义。

然而，纤维素的结构复杂，由葡萄糖单体通过β-1,4-糖苷键连接而成的长链聚合物，分子间和分子内存在大量的氢键，形成了高度结晶的结构，使其难以被微生物直接利用。将纤维素转化为可发酵性糖进而生产燃料乙醇的关键在于纤维素酶。纤维素酶能够特异性地催化纤维素的水解反应，将其分解为葡萄糖等可发酵性糖，为后续的乙醇发酵提供原料。在纤维素酶系中，绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ（EGⅠ）是一种重要的内切葡聚糖酶，它能够随机切割纤维素分子内部的β-1,4-糖苷键，产生不同长度的寡糖和新链的末端，为外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的进一步作用提供底物，在纤维素的降解过程中发挥着关键作用。

目前，纤维素酶的生产成本较高，限制了纤维素燃料乙醇的大规模工业化生产。提高纤维素酶的性能，降低生产成本，成为纤维素生物转化领域的研究热点。对绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因进行深入研究，通过基因工程技术实现其在大肠杆菌中的高效表达，并对其进行分子改造，有望提高纤维素酶的活性、稳定性和特异性，降低生产成本，从而提高生物质转化效率，推动纤维素燃料乙醇产业的发展，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2纤维素与纤维素酶概述

1.2.1纤维素结构及应用现状

纤维素是由D-吡喃葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖，分子式为（C?H??O?）n，其中n代表聚合度，其值可从几百到上万不等。纤维素分子链之间通过大量的氢键相互作用，形成了高度有序的结晶区和相对无序的非结晶区，这种复杂的结构赋予了纤维素较高的机械强度和化学稳定性。

在自然界中，纤维素广泛存在于植物细胞壁中，是植物支撑结构的重要组成部分。棉花是纤维素含量最高的天然植物纤维，其纤维素含量可达90%以上；木材中纤维素含量一般在40%-50%左右；农作物秸秆如玉米秸秆、小麦秸秆等也富含大量的纤维素，是重要的纤维素资源。纤维素在工业、食品、医药等领域有着广泛的应用。在工业领域，纤维素是造纸、纺织、纤维板等行业的重要原料；在食品领域，纤维素作为膳食纤维，有助于促进肠道蠕动，维持人体健康，同时也被用作食品添加剂，如增稠剂、稳定剂等；在医药领域，纤维素可用于制备药物载体、缓释制剂等。然而，由于纤维素的结构复杂，难以被有效利用，目前大部分纤维素资源未得到充分开发，造成了资源的浪费。

1.2.2纤维素酶系组成及降解纤维素机理

纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的复合酶系，主要由内切葡聚糖酶（Endoglucanase，EG，EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（Cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91）和β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，BG，EC3.2.1.21）组成。这三种酶协同作用，共同完成纤维素的降解过程。

内切葡聚糖酶（EG）能够随机切割纤维素分子内部的β-1,4-糖苷键，作用于纤维素的非结晶区，使纤维素长链断裂，产生不同长度的寡糖片段和新的末端，增加纤维素分子的可及性；外切葡聚糖酶（CBH）则从纤维素链的非还原性末端或还原性末端依次水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；β-葡萄糖苷酶（BG）将外切葡聚糖酶作用产生的纤维二糖水解为葡萄糖，从而完成纤维素到葡萄糖的降解过程。1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，认为纤维素的降解需要C1酶（相当于外切葡聚糖酶）和Cx酶（相当于内切葡聚糖酶）的协同作用，首先C1酶作用于结晶纤维素，使其结构发生改变，然后Cx酶作用于非结晶区，将纤维素分解为纤维二糖，最后由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。虽然该假说得到了广泛的认可，但随着研究的深入，发现纤维素酶的协同作用顺序并非绝对固定，不同来源的纤维素酶在降解纤维素时可能存在差异。

1.2.3内切葡聚糖酶分子结构特点

内切葡聚糖酶（EG）具有独特的分子结构，一般由催化结构域（Catalyticdomain，CD）、纤维素结合结构域（Cellulosebindingdomain，CB