Westernblot技术详细PPT课件.pptxVIP

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蛋白样品(yàngpǐn)的制备

裂解液：

裂解成份

促溶成份

蛋白酶抑制成份;

产品名称;;

凝胶成份

(chéng

fèn)

◆丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺

◆SDS

配胶的Tris缓冲液

TEMED

◆过硫酸铵(时间(shíjian))

Tris-甘氨酸电泳缓冲液;

SDS分离胶浓度;

CastingStand

CastingFrame

andGlass

PlateSandwich

n

PlasticCombs

GlassPlateswith;;

拔梳子要

均匀用力

左右同起

缓慢向上拔出;;;

20-40KDa100mv40min60-80KDa110mV120min

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●脱脂奶粉(5%)

●BSA

·WesternBlot膜封闭液(生物(shēngwù)试剂 公司提供);

·把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4℃过夜。

·倒掉一抗溶液，用TBST漂洗(piāoxi)液滤膜3次，每次10min。

·加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37℃一小时，4℃过夜。

·倒掉二抗溶液，用TBST漂洗(piāoxǐ)液滤膜3次，每次10min。;;;

胶板洗刷干净

加入(jiarù)APS和TEMED的量要合适

加入(jiarù)试剂后摇匀，使其

充分混合，防止部分胶块聚合不均匀

温度合适，受热不均匀导致胶

聚合不均匀

两块玻璃板底部要对齐;

凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗(qīngxǐ)加样孔要小心，以免把上样带扭曲

样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度

胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时

注意电泳槽装置是否合适;

可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min

电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构(jiégòu)不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的滤纸确保膜和胶块之间没有气泡

缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程

注意降温;;

增加抗体滴度，延长孵育

时间

增加样本上样量

所用溶液和容器中避免含

有叠氮化钠

大分量蛋白相应增加转膜

时间及曝光时间;;;