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WesternBlot实验原理

·WesternBlot中文一般称为蛋白质印迹。它是

分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是把通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质变为可见、可分析的灰色条带，通过分析条带的位置和条带着色深度获;;;

(一)蛋白样品制备

·4、每瓶细胞加400μ1含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

·5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的

一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

·6、于4℃下12000rpm离心5min。(提前开离心机预冷)

·7、将离心后的上清液分装转移至离心管中放于一

20℃保存。;;

(二)蛋白含量的测定

4.配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至

0.5mg/m1,若配200u1的0.5mg/m1蛋白标准溶液则需要50u1的2mg/ml的蛋白标准溶液和150u1PBS溶液

5.将稀释好的样品加入孔板中(标记的区域),接着标准品按0,1,2,4,8,12,16,20u1加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20u1

6.每孔加200u1配好的工作液，平行加，不能上下加，以减少误差

7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟;

(二)蛋白含量的测定

8.孵育完后，放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速，吸光值

595nm,进行比色测定，记录标准曲线及样品吸光值数据后，以蛋白含量(m1)为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。(R20.98才有用，酶标仪操作：两个箭头图标，1是结果，2是保存)

9.计算蛋白含量(注意定量样品已经稀释了10倍);;;

(三)凝胶电泳

1、制胶;

5%pH6.8

分离胶10%pH8.8

特点pH不连续

凝胶不连续

缓冲液成分不连续;;;;;

Directionof

electric

current

Gelcassette

Foamsponge

Filterpaper

Nylonmembrane

Gel

Filterpaper

Foamsponge;

方法仪器;;;;

(四)转膜

4.转膜后确认

◆丽春红

·可逆染色，检测转膜效率。

·与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。

◆蛋白预染Marker

·实时监测

·分子量参照

·与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检测转膜效率。

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(六)免疫反应

2.二抗

注???1.抗体与牛奶比例：1:5000,;

显色方法;;

现象;

现象;

信号弱或无信号;

荧光萃灭快;

谢谢

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谢谢观看

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