WB-Western-Blot实验步骤及讲解ppt课件.pptxVIP

WesternBlot;

概念

通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品

进行着色，通过分析着色的位置、深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

WWVC

一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。

因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。;

分类

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)

SDS中的蛋白需先变性展开再进行研究，主要是根据蛋

白的质量在凝胶中进行分离，特别适用于评估蛋白质量的变化。

Native;

原理

酶标二抗_

HRP

HRP

一抗

封闭剂

目的蛋白

;

前期准备——蛋白提取

器材：匀浆器、EP管(10ml、1.5ml、100ul)、弯镊、96孔板、冰盒

酶标仪、低温离心机、电子秤等

试剂：蛋白裂解液、PMSF工作液/蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、

BCA蛋白浓度测试盒、5×蛋白上样缓冲液;

1.于-20℃冰箱取出蛋白裂解液及PMSF等，常温下溶解；BCA测试盒、5×Buffer置冰上备用；将已高压消毒的匀浆器及弯镊置冰上冷却备用；开启低温离心机调至4℃备用、烤箱调至37℃备用。

2.组织样本于冰上冻融后，称取适量组织(约30-50mg)放入匀浆器中，准确记录所夹取组织重量。

3.计算应加入裂解液和PMSF的体积：蛋白裂解液(ul)=组织重量(mg)×12、PMSF(ul)=组织重量(mg)×0.2。根据上述数值将液体分别加入匀浆器中。

4.于匀浆器中碾磨，至无肉眼可见组织即可，用移液枪将碾磨后的液体转移至1.5mlEP管内，静置30min,每5min摇晃混匀以便裂解液和组织充分发生反应。;

蛋白提取步骤

5.上述裂解液于低温离心机内离心，12000rpm×15min,4℃。

6.离心完成后，小心取出离心管，可见液体分成3层，上层为白色脂肪层，中层为澄清蛋白质溶液，下层为组织沉淀，用适当量程的移液枪小心吸取中间层蛋白溶液于1.5mlEP管中，记录所吸取体积(ul)。

注意：宁可少吸不可多吸!

脂肪层←

蛋白质溶液←

组织沉淀←;

7.打开96孔板，标记加样，进行蛋白浓度测定。;

0.1095

0.1115;

conF1/12w/male;

蛋白提取步骤

10.蛋白变性。按照蛋白??液体积：5×上样缓冲液=4:1的比例，在对应

样本中加入5×上样缓冲液后煮沸5min,室温冷却后置-80℃冰箱保存。

WWAO

蛋白煮沸变性一般是95~100°C,5~10min,水浴锅煮沸时，可用

带夹EP管防止EP管盖弹开，使水浴锅内的水进入而使样品废掉。

;

前期准备

材料：蛋白样本(已变性)

器械：玻璃板(厚板及薄板)、玻璃板架、梳子、枪头、移液枪、PVDF膜、滤纸、口罩、手套;

1;

实验步骤

1.配制SDS凝胶

(1)将玻璃板对应安装至玻璃架，配制相应浓度的分离胶(按照每块凝胶需5ml混合液的量计算)。

(2)加入TEMED混匀后，立即灌入两块玻璃板之间的空隙，每块凝胶约需分离胶4ml。灌胶完成后立即用无水乙醇封边。

(3)室温静置待胶凝固，倒掉上层封边液体，并用滤纸吸干上层空间。

(4)配制浓缩胶，每块凝胶约需2ml,加入分离胶的上层空间后，立即插入相应尺寸的梳子。

(5)室温静置。

注意：清洗玻璃板!防止起泡产生!注意TEMED毒性，避免吸入和接触!;

蛋白质分子量范围KD;

2、SDS凝胶电泳

(1)配制电泳液及电转液(电转液的甲醇在使用前添加，加入后置于4度冰箱待用)。

(2)将玻璃板安装于电泳槽架子上以后，向内加入少许电转液观察是否有漏液，若无即可放入电泳槽中，若有漏液需重新夹取玻璃板。

(3)轻轻拔出凝胶中的梳子，两侧用力均匀保证加样孔无歪斜。

(4)将电泳槽内外均加入足量电泳液以后，开启电泳仪电源，将电压调为60V,预电泳15min,疏通凝胶分子孔径。

(5)预电泳完成后进行蛋白加样。若有多余孔道需用1×Buffer封边，并设置一孔加入预染Marker。

(6)电泳。电压调为80V使蛋白样品在浓缩胶内电泳，然后将电压调为110V使蛋白样品在分离胶内电泳，至所需目的蛋白充分分离后停止(根据Marker所标记位置估计切胶宽度≥1cm)。;

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