鲁西黄牛耳组织cDNA文库构建及Tβ4基因克隆表达解析.docxVIP

鲁西黄牛耳组织cDNA文库构建及Tβ4基因克隆表达解析

一、引言

1.1研究背景

鲁西黄牛作为我国五大良种黄牛之一，原产于山东省西南部的济宁、菏泽两地区境内，是我国重要的地方优良牛种。它一直以体躯大、遗传性能稳定、挽力强、耐粗饲、易管理、适应性强、皮质紧实以及肉质好而著称，在20世纪90年代以前是当地重要的役用牲畜。但随着农业机械化的普及，其役用价值逐渐降低。同时，国外良种肉牛的大量引进以及与当地黄牛品种的杂交改良，使得鲁西黄牛的体型、体重以及产肉优势下降，养殖经济效益远不如良种肉牛或改良肉牛。农户养牛役用需求减少，养牛场也多倾向于选择良种肉牛或改良肉牛养殖，导致鲁西黄牛存栏数量急剧减少，目前已处于濒危状态，存栏数量不足以前的1%，其遗传资源面临着严重的威胁。

构建cDNA文库是保存生物遗传资源的重要手段之一。cDNA文库包含了生物体特定组织或细胞在某一发育阶段或生理状态下的全部mRNA反转录形成的cDNA序列，能够反映该组织或细胞中基因的表达情况。对于鲁西黄牛而言，构建其cDNA文库可以有效地保存其遗传信息，为后续的基因研究和遗传资源保护提供基础材料。通过对cDNA文库的研究，我们可以深入了解鲁西黄牛的基因组成、基因表达调控机制以及遗传多样性等，这对于揭示鲁西黄牛独特的生物学特性和优良性状的遗传基础具有重要意义。

胸腺肽β4（Tβ4）基因是近年来研究较多的一个基因，它编码的胸腺肽β4是一种具有多种生物学功能的小分子多肽。Tβ4在细胞迁移、增殖、分化以及组织修复和再生等过程中发挥着关键作用。在动物研究中发现，Tβ4基因的表达与动物的生长发育、免疫调节、伤口愈合等生理过程密切相关。例如，在绒山羊中，通过转基因技术将Tβ4基因导入绒山羊基因组中，能够显著提高绒山羊的产绒量，且对绒毛细度及绒毛品质无不良影响。在心脏损伤动物模型中，Tβ4可以减少疤痕量、增加心脏功能和生存能力。对于鲁西黄牛，研究Tβ4基因的功能和表达调控机制，可能有助于揭示其生长发育、肉质形成以及抗病能力等方面的遗传机制，为鲁西黄牛的品种改良和遗传育种提供新的靶点和理论依据。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过提取鲁西黄牛耳缘组织成纤维细胞中的总RNA，采用SMART技术构建鲁西黄牛耳组织cDNA文库，并利用该文库筛选克隆Tβ4基因，构建其原核表达载体，诱导Tβ4基因在大肠杆菌中表达，从而为深入研究Tβ4基因在鲁西黄牛中的生物学功能奠定基础。

本研究对于鲁西黄牛遗传资源的保护和利用具有重要意义。鲁西黄牛作为我国珍贵的地方牛种，其遗传资源的保护迫在眉睫。构建cDNA文库可以将鲁西黄牛的遗传信息以稳定的形式保存下来，为后续的遗传研究和资源开发提供基础。同时，对Tβ4基因的克隆与表达研究有助于揭示鲁西黄牛生长发育、肉质形成等重要经济性状的遗传机制，为鲁西黄牛的品种改良和遗传育种提供新的思路和方法，促进鲁西黄牛产业的可持续发展。从学术角度来看，本研究丰富了牛基因功能研究的内容，为进一步了解动物基因表达调控网络和生物学过程提供了有价值的参考，有助于推动动物遗传学和分子生物学的发展。

1.3国内外研究现状

在鲁西黄牛遗传研究方面，国内学者已开展了一系列工作。毛永江等利用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和水平淀粉凝胶电泳技术检测了鲁西黄牛21个编码血液蛋白（酶）的结构基因座的基因频率，分析了其遗传多样性，发现鲁西黄牛群体内遗传变异水平相对较高，平均杂合度为0.1416。周芬娜等采用RAPD分子遗传标记技术，检测了鲁西黄牛的遗传多样性现状，得到RAPD标记位点109个，多态性位点95个，占总位点数的87.16%，表明鲁西黄牛群体具有较高的遗传多样性。这些研究为鲁西黄牛遗传资源的评价和保护提供了重要依据，但对于鲁西黄牛基因功能的深入研究还相对较少。

在cDNA文库构建方面，国内外已在多种动物中成功构建了cDNA文库。关伟军等以cDNA文库形式构建并保存了鲁西黄牛等22个畜禽品种的基因资源，但对于文库中特定基因的筛选和功能研究还需进一步深入。构建高质量的cDNA文库需要优化RNA提取、反转录以及文库构建等关键技术环节，以提高文库的滴度、重组率和插入片段大小等指标，为后续基因研究提供优质材料。

关于Tβ4基因的研究，国外RegeneRxBiopharmaceuticalsInc.公司围绕Tβ4开发出了三条主管线，包括用于治疗干眼病和神经营养性角膜炎的RGN-259、治疗全身组织和器官损伤的RGN-352以及加速真皮伤口愈合的RGN-137。国内在动物方面，刘东军研究员课题组利用CRISPR/C