T_CVMA 158-2024 牛分枝杆菌抗体荧光偏振检测方法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/CVMA158—2024

牛分枝杆菌抗体荧光偏振检测方法

Fluorescencepolarizationassayfordetectionofantibodiesagainst

Mycobacteriumbovis

2024-5-8发布2024-5-8实施

中国兽医协会发布

I

T/CVMA158—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由上海市动物疫病预防控制中心提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心、山东生科尚仪生物技术有限公司。

本文件主要起草人：杨显超、于慧茹、王建、赵洪进、庄勇、杨德全、鞠厚斌、李鑫、沈海潇、葛菲菲、向蒙、冯桂丹、张玉杰、唐聪圣、卢军。

T/CVMA158—2024

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牛分枝杆菌抗体荧光偏振检测方法

1范围

本文件规定了牛分枝杆菌抗体荧光偏振试验的试验原理、试剂和材料、仪器设备、样品的采集和保存、操作方法和结果判定。

本文件适用于对牛分枝杆菌抗体的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

荧光偏振方法的原理：溶液中的分子作随机转动，大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光。将牛分枝杆菌三种特异性蛋白质MPB70、MPB83和ESAT-6的重组融合蛋白用硫氰荧光素（FITC）进行标记作为抗原，当加到待检血清中，若有相应抗体与标记抗原结合，就会降低其转动速度，发射更多的偏振光，用荧光偏振仪检测待检血清的偏振光增加值即可判断血清中是否存在牛分枝杆菌抗体。

5试剂和材料

5.1试剂

5.1.1总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。

5.1.2阳性对照：牛分枝杆菌抗体阳性血清。

5.1.3阴性对照：牛分枝杆菌抗体阴性血清。

5.1.4样品稀释缓冲液配制方法见附录A。

5.1.5结合物：用硫氰荧光素（FITC）标记牛分枝杆菌MPB70、MPB83和ESAT-6重组融合蛋白。

5.2材料

2

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5.2.196孔黑色平板微孔板。

5.2.2移液器吸头。

6仪器和设备

6.1荧光偏振仪。

6.2微量板振荡器。

6.3微量移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）。

7样品的采集与处理

按照NY/T541进行。使用不含抗凝剂的采血管或注射器采集血液，分离血清。

8操作方法

8.1将试剂和样品恢复至室温。

8.2制备的样品稀释缓冲液应避免有颗粒物，配置后的溶液放置室温保存，需在1个月内使用。

8.3分别取20μL阴性对照加入96孔黑色平板微孔板A1、B1、C1孔中，取20μL阳性对照加入96孔黑色平板微孔板D1孔中。取20μL待检血清样品加入96孔黑色平板微孔板内其余相应孔中。向96孔黑色平板微孔板加样或加液体时应避免气泡产生。

8.4取180μL样品稀释缓冲液加入到96孔黑色平板微孔板的每个反应孔中，置振荡器上振荡2min。

8.5将96孔黑色平板微孔板室温孵育3min～5min后，置荧光偏振仪上读取阴阳性对照和样品的初始值，作为空白偏振值。

8.6取10μL结合物加入到每个反应孔中，置振荡器上振荡2min。

8.7将96孔黑色平板微孔板置室温孵育2min～3min，置荧光偏振仪上读取最终偏振值。

9结果判定

对照或样品的偏振值计算见式（1）：

FP=A-B（1）

式中：

FP——对照或