抗人B7-2单链抗体基因的构建与表达：从基础到应用的深度探索.docxVIP

抗人B7-2单链抗体基因的构建与表达：从基础到应用的深度探索

一、引言

1.1研究背景

在免疫学研究领域，单链抗体凭借其独特的优势，成为了备受瞩目的研究对象。单链抗体（singlechainantibodyfragment，scFv）是一种由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过特定短肽连接而成的抗体，其能够保持对目标抗原的良好亲和能力。并且，单链抗体具有较小的分子量，这赋予了它较强的穿透能力，使其更容易渗透进入肿瘤组织等实体组织，增强药物治疗的效果。同时，单链抗体的抗原性较弱，免疫源性较低，能够减少人体对鼠源抗体的排斥反应，在体内的循环半衰期较短，有利于快速清除和解毒。此外，单链抗体还易于与毒素或酶基因结合，从而方便地制备免疫毒素或酶标记抗体，在疾病的诊断和治疗中展现出巨大的应用潜力。

B7-2分子，又称CD86，是免疫球蛋白超家族成员，在免疫领域占据着举足轻重的地位。它广泛表达于激活的B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和星形胶质细胞表面。在免疫反应中，B7-2起着关键的共刺激分子作用。当抗原提呈细胞（APC）摄取、加工处理抗原后，会将抗原肽-MHC复合物呈递给T细胞，此时T细胞的有效活化需要两个信号。第一信号由抗原肽-MHC复合物与TCR-CD3结合提供，而第二信号则主要由共刺激分子介导，其中B7-2与T细胞表面的CD28分子结合，为T细胞的活化、增殖和细胞因子产生传递共刺激信号，对免疫应答的启动和调节至关重要。此外，B7-2还能与CD152（CTLA-4）结合，向T细胞传递抑制信号，调节免疫反应的平衡，避免免疫反应过度激活对机体造成损伤。

鉴于单链抗体的诸多优势以及B7-2分子在免疫领域的重要地位，开发抗人B7-2单链抗体作为治疗药物具有极大的潜力。通过构建抗人B7-2单链抗体基因并实现其表达，有望获得能够特异性识别并结合B7-2分子的单链抗体，为深入研究B7-2分子的功能机制以及开发相关疾病的治疗方法提供有力工具。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过一系列生物技术手段，构建抗人B7-2单链抗体基因，并实现其在合适表达系统中的高效表达。具体而言，首先从稳定分泌鼠抗人B7-2杂交瘤细胞株中扩增并克隆出该单克隆抗体的重链（VH）和轻链（VL）可变区基因。然后，运用重叠延伸PCR（SOE-PCR）方法，在VH和VL可变区基因之间引入连接肽（Gly4Ser）3，从而在体外构建抗人B7-2单链抗体（B7-2ScFv）基因。为了便于后续对表达产物的纯化，在抗人B7-2ScFv的C端增加6×Histag序列。最后，将构建好的基因克隆至合适的表达载体，并在大肠杆菌等表达系统中进行原核表达，对表达产物进行分析和纯化。

抗人B7-2单链抗体基因的构建及表达研究具有重要的理论和实际意义。在理论方面，有助于深入了解B7-2分子在免疫调节中的作用机制，为免疫学理论的发展提供新的实验依据和研究思路。通过研究抗人B7-2单链抗体与B7-2分子的相互作用，可以进一步揭示免疫细胞活化、增殖以及免疫反应平衡调节的分子机制，丰富对免疫系统复杂网络的认识。

在实际应用中，该研究成果具有广阔的应用前景。对于肿瘤治疗领域，B7-2分子在肿瘤免疫逃逸中发挥着重要作用。肿瘤细胞可以通过上调B7-2的表达，与T细胞表面的CD28或CTLA-4结合，调节T细胞的活性，从而逃避机体的免疫监视。抗人B7-2单链抗体能够特异性阻断B7-2与T细胞表面受体的结合，打破肿瘤细胞的免疫逃逸机制，激活T细胞的抗肿瘤活性，为肿瘤免疫治疗提供新的策略和手段。在自身免疫性疾病的治疗中，由于免疫调节失衡导致机体对自身抗原产生免疫反应。抗人B7-2单链抗体可以通过调节B7-2介导的共刺激信号，纠正免疫失衡，抑制过度的免疫反应，为自身免疫性疾病的治疗提供新的途径。此外，抗人B7-2单链抗体还可作为研究工具，用于相关疾病的诊断和发病机制研究，推动免疫学和医学领域的发展。

二、抗人B7-2单链抗体基因构建的理论基础

2.1单链抗体概述

单链抗体（singlechainantibodyfragment，scFv）是一种通过基因工程技术构建的新型抗体。它由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段特定的短肽连接而成。这种独特的结构使得单链抗体既保留了传统抗体对抗原的特异性识别和结合能力，又具备了一些传统抗体所不具备的优势。

从结构特点来看，单链抗体的分子量相对较小，通常仅为完整抗体的六分之一左右，大约在25Kd。较小的分子量赋予了单链抗体较强的穿