用于循环肿瘤细胞定量分析的CK19数字PCR检测方法的建立及性能验证.pdfVIP

Hereditas(Beijing)2023年3月,45(3):250―260技术与方法

用于循环肿瘤细胞定量分析的CK19数字PCR检测

方法的建立及性能验证

1,2221,22

马春辉，胡海旭，张丽娟，刘毅，刘天懿

1.安徽医科大学基础医学院，合肥230032

2.中国人民解放军总医院第五医学中心，北京100071

摘要:本研究拟建立检测CK19基因表达的数字PCR(digitalPCR，dPCR)方法并测试其性能，以期利用该方法

的超高敏感性和绝对定量优势进行循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTC)的定量分析。首先，根据CK19基

因的mRNA序列进行引物探针设计，以看家基因ABL1作为内参，采用人乳腺癌MCF7细胞和健康人白细胞从

13套引物探针之中筛选出了最佳的引物探针，测序结果证实扩增序列无误。其次，针对选定的引物探针进行

反应条件的优化，以不同浓度的健康人白细胞cDNA为模板进行空白检测限(limitofblank，LOB)的分析，证

实当ABL1基因拷贝数为20,000、15,000、10,000、5000、2500时，CK19的LOB分别为9.24、8.93、3.12、3.17

和2.53拷贝。再次，采用MCF7细胞和健康人白细胞的cDNA模板进行不同浓度预混的检测限(limitofdetection，

LOD)分析，证实50%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%的浓度配比下均可以有效检出CK19基因，线性R2值为

0.9998。最终，临床样本的数字PCR检测结果发现晚期乳腺癌患者的CK19拷贝数高于健康人对照。上述结果

说明本研究所建立的检测CK19基因的数字PCR方法具有敏感、特异和定量准确等优势，未来经过进一步验证

之后有望用于乳腺癌的CTC定量分析，具有良好的应用前景。

关键词:循环肿瘤细胞；细胞角蛋白19；数字PCR；乳腺癌；定量分析

EstablishmentandverificationofadigitalPCRassayforthe

detectionofCK19expressioninquantitativeanalysisofcirculating

tumorcell

1,2221,22

ChunhuiMa,HaixuHu,LijuanZhang,YiLiu,TianyiLiu

1.SchoolofBasicMedicalSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

2.TheFifthMedicalCenterofPeople′sLiberationArmyGeneralHospital,Beijing100071,China

Abstract:TheobjectiveofthisstudywastoestablishandverifyadigitalPCRassayforthedetectionofCK19gene

expression,andtouseittodetectcirculatingtumorcells(CTC)bytakingadvantagesofitsultra-highsensitivityand

absolutequantitation.Firstly,theprimersandprobesweredesignedaccordingtothemRNAsequenceofCK19gene,and

收稿日期:20221115;修回日期:20230103;网络发布日期:20230110

基金项目:国家自然科学基金项目(编号，82241