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实验九、细胞传代与冻存
⚫实验目的：掌握细胞复苏的方法，能独立地进行细胞复苏的接种操作。
⚫实验原理：
•当细胞在培养皿中长满后就需要将其稀释分种成多个培养皿,细胞才能
继续生长.这一过程就叫传代.传代培养可获得大量细胞供实验所需.
•利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离
生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于
实验。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％．15％的甘油或
二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细
胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融
的方法能较好地保证细胞存活。冷冻速度开始为-1到-2℃／min，
当温度低于-25℃时可加速，到-80℃可直接投入液氮内(-196℃)。
实验材料
细胞株：培养的HeLa细胞
器材冻存管、离心管、枪头、水浴锅等
:5ml60mmDish,
试剂：DMEM培养基、小牛、DMSO、胰蛋白酶
实验步骤：细胞传代
1.先准备好新培养皿，加入4.3mlDMEM，0.5mlFBS.
2.用5ml枪头吸掉培养皿中的旧培养基，用3mlPBS洗去残留的旧
培养基后，吸掉PBS，加入0.5ml胰酶，充分覆盖细胞后，吸掉
胰酶，室温静置2-3分钟，待细胞变圆漂浮起来后（可在倒置显
微镜下观察），加入4mlDMEM吹洗细胞，制成悬浮细胞,移入
5ml离心管中，1200rpm离心5分钟。去上清后，加入
1mlDMEM充分混匀细胞，取200ul加入上述准备好的培养皿中，
最后移入CO培养箱中继续培养。（每组传一盘即可）
2
实验步骤：细胞冻存
1.冻存液的准备：取5ml离心管一个，按照7:2:1的比例分别加入
DMEM、FBS、DMSO，终体积为2ml.
2.用5ml枪头吸掉培养皿中的旧培养基，用3mlPBS洗去残留的
旧培养基后，吸掉PBS，加入0.5ml胰酶，充分覆盖细胞后，
吸掉胰酶，室温静置2-3分钟，待细胞变圆漂浮起来后（可在
倒置显微镜下观察），加入4mlDMEM制成悬浮细胞,移入5ml
离心管中，1200rpm离心5分钟。去上清后，加入1ml上述冻
存液，充分悬浮细胞，然后将细胞悬液移入冻存管中。在冻
存管表面标明日期、细胞名称、。
3.将冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出
冻存管，移入液氮容器内。(每组冻存一管)
思考题
•细胞传代培养的目的？
•简述冻存细胞的过程
实验十、荧光显微镜与暗视野
显微镜的使用
一、荧光显微镜的成像原理
荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其
基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激
发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品
结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
什么是荧光?
◼物质中的电子吸收光的
能量由低能状态转变为
高能状态，再回到低能
状态时释放出的光。
◼即：物质吸收短波光，
出的长波光。
荧光的性质
◼保持固有的荧光特性
◼荧光波长＞激发波长
◼荧光强度极小于激发光的强度
◼有不同程度的衰减
◼荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度
荧光的种类
自发荧光二次荧光
荧光显微镜的优点和用途
优点：
◼检出能力高
◼对细胞的刺激小
◼能进行多重染色
用途：
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