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牛分枝杆菌基因分型技术的构建与应用探索

一、引言

1.1研究背景与意义

牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis）作为结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTC）的关键成员，是引发牛结核病（Bovinetuberculosis）的主要病原菌。牛结核病在2016年被国际兽医局列为须申报的14类牛传染病之一，其对畜牧业的危害不容小觑。患病牛不仅生长发育受阻、生产性能大幅下降，如奶牛产奶量减少、肉牛体重增长缓慢等，还会导致高死亡率，给养牛业带来沉重的经济负担。

牛结核病是一种人畜共患的慢性消耗性传染病，严重威胁着动物性食品安全和人类的健康。人类主要通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而感染牛分枝杆菌。感染后，可能引发肺结核、淋巴结核、骨结核等多种疾病，对人体健康造成极大损害。在我国，农村和边远地区是结核病的高发地区，由于医疗卫生条件相对落后、人们对牛结核病的防控意识不足等原因，牛结核病在牛和人间的传播较为严重，成为导致结核病流行的关键环节之一。

准确、快速地进行牛分枝杆菌基因分型具有至关重要的意义。通过基因分型，可以及时确定病原，追踪传染源，监控病原进化，调查传播途径，从而为制定科学有效的防控策略提供依据。例如，在牛结核病暴发时，利用基因分型技术能够迅速锁定传染源，采取针对性的隔离、扑杀等措施，防止疫情进一步扩散；通过对不同地区牛分枝杆菌基因型的监测，可以了解其传播规律和变异趋势，为疫苗研发和防控措施的调整提供参考。因此，建立有效的牛分枝杆菌基因分型技术是牛结核病防控工作中的关键环节，对于保障畜牧业的健康发展和人类的身体健康具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在国外，基因分型技术在牛分枝杆菌研究中应用较早且较为广泛。基于插入序列IS6110限制性片段长度多态性（Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）分析法（IS6110-RFLP）是较早应用的基因分型方法之一。该方法通过分析IS6110在牛分枝杆菌基因组中的插入位点和拷贝数的差异，来区分不同的菌株。然而，IS6110-RFLP操作较为繁琐，需要大量的DNA，且结果分析复杂，限制了其在大规模检测中的应用。

以PCR为基础的间隔区寡核苷酸分型（Spaceroligonucleotidetyping，Spoligotyping）技术因其操作相对简便、快速，成为目前常用的基因分型方法之一。Spoligotyping通过检测结核分枝杆菌复合群基因组中直接重复序列（Directrepeat，DR）区域内间隔区寡核苷酸的多态性，对菌株进行分型。许多国家利用该技术对牛分枝杆菌进行了分子流行病学调查，了解了不同地区牛分枝杆菌的基因型分布情况。例如，在欧洲一些国家，通过Spoligotyping分析发现，某些基因型的牛分枝杆菌在特定地区呈现优势流行。

数目可变串联重复序列（Variablenumbertandemrepeats，VNTR）和分枝杆菌散在分布重复单元（Mycobacterialinter-spersedrepetitiveunit，MIRU）分型法也得到了广泛应用。这两种方法常联合运用，称VNTR-MIRU。VNTR-MIRU通过检测基因组中多个VNTR和MIRU位点的重复次数差异来进行分型，具有较高的分辨率和重复性。在非洲、美洲等地区的研究中，VNTR-MIRU被用于追踪牛分枝杆菌的传播途径和传染源，取得了良好的效果。

在国内，随着养牛业的发展和对牛结核病防控的重视，牛分枝杆菌基因分型技术的研究也逐渐增多。杜艳芬等人收集东北、西北、华北、华南4个地区分离的10株牛分枝杆菌分离株，分别采用Spoligotyping和VNTR-MIRU对这些分离株进行基因分型，比较两种方法的分型效果，评价其在牛分枝杆菌基因分型中的应用。结果表明，使用Spoligotyping方法，10株牛分枝杆菌呈现出4种基因型，使用VNTR-MIRU方法，10株分离株也呈现4种基因型；当两种方法联合使用时，可以分为5种基因型，其中的2个菌株具有独特的基因型，显示来自不同地区的牛分枝杆菌存在主要的流行型为BCG家族。张永亮等人对牛分枝杆菌基因分型技术的研究进展进行了综述，详细介绍了各种基因分型方法的原理、优缺点和适用范围，为国内相关研究提供了重要的参考。

尽管国内外在牛分枝杆菌基因分型技术方面取得了一定的进展，但仍存在一些问题和挑战。不同基因分型方法的分辨率、重复性和操作难度各不相同，如何选择合适的基因分型方法或组合，以提高分型的准确性和效率，是需