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组织切片与显微摄影技术

CATALOGUE

目录

01

样本制备基础

02

切片处理技术

03

显微设备操作

04

显微摄影流程

05

常见问题处理

06

质量与标准化

01

样本制备基础

组织固定原理与方法

化学固定剂的选择

根据组织类型和研究目的选择醛类（如甲醛）、醇类或氧化剂等固定剂，以保持细胞形态并防止自溶或腐败。

物理固定技术

采用冷冻固定或微波固定等物理方法，快速终止细胞代谢活动，减少人工假象，适用于特殊样本如神经组织或酶活性研究。

固定时间与渗透控制

优化固定时间以避免过度交联导致抗原表位遮蔽，同时确保固定液充分渗透至组织深层，尤其对致密组织如骨骼或肿瘤需延长固定周期。

脱水包埋流程优化

石蜡包埋温度调控

根据组织特性调整石蜡熔点和浸蜡温度（通常55-60℃），确保包埋介质均匀填充组织间隙，避免气泡或收缩裂隙。

03

使用二甲苯或环保型透明剂（如柠檬烯）置换酒精，增强石蜡渗透性，需控制透明时间以防组织脆化。

02

透明剂替代策略

梯度酒精脱水法

采用从低浓度（30%）到高浓度（100%）的酒精梯度脱水，逐步置换组织水分，避免剧烈收缩或变形，尤其对胚胎或脂肪组织需缓慢过渡。

01

切片厚度与刀具选择

多数组织切片厚度设定为4-6微米，兼顾光学显微镜分辨率和结构完整性；超薄切片（1-2微米）用于高分辨率研究如肾小球或视网膜分层。

常规切片厚度标准

刀具材质与角度

防皱褶与展片技巧

硬质合金或钻石刀适用于坚硬组织（如骨或植物样本），刀刃角度（通常15-35°）影响切片平整度，需根据样本硬度调整。

采用温水浴（40-45℃）或蛋白甘油粘附剂辅助展片，消除切片褶皱，尤其对大面积或纤维性组织（如肌肉或胶原）需精细操作。

02

切片处理技术

常规染色（HE）操作规范

使用高纯度石蜡进行包埋，切片厚度通常控制在4-6微米，需保持刀片锋利以避免组织撕裂或褶皱。

石蜡包埋与切片厚度

苏木精-伊红染色步骤

透明与封片操作

采用中性缓冲福尔马林固定组织，确保结构完整性；梯度乙醇脱水需严格控制时间，避免组织过度收缩或硬化。

苏木精染色后需盐酸乙醇分化，伊红染色需控制浓度和时间，确保细胞核与胞质对比清晰。

染色后通过二甲苯透明，中性树胶封片，避免气泡产生并确保长期保存稳定性。

组织固定与脱水处理

特殊染色技术应用

胶原纤维染色（Masson三色法）

用于区分胶原纤维（蓝色）、肌纤维（红色）和细胞核（黑褐色），适用于纤维化疾病研究。

糖原与黏液染色（PAS/AB法）

过碘酸雪夫染色（PAS）显示糖原，阿辛蓝（AB）标记酸性黏液，联合应用可鉴别分泌性病变。

神经纤维染色（银浸染法）

通过Bielschowsky或Gomori银浸染技术突显神经元轴突和树突，用于神经病理学诊断。

脂肪染色（油红O法）

冷冻切片中采用油红O染色脂滴，适用于动脉粥样硬化或脂肪代谢异常研究。

封片介质与防损伤措施

中性树胶选择

封片环境控制

防脱片剂预处理

长期保存条件

需选用折射率与玻璃相近（约1.52）的中性树胶，避免长期存放后出现结晶或褪色现象。

玻片涂覆多聚赖氨酸或APES胶，增强组织黏附性，防止染色过程中切片脱落。

封片时需保持湿度低于40%，温度20-25℃，避免介质过快固化或产生裂纹。

切片应避光存放于干燥环境中，定期检查封片边缘是否开裂或介质氧化发黄。

03

显微设备操作

显微镜类型与光学配置

光学显微镜基础分类

包括正置显微镜（观察切片常用）、倒置显微镜（用于活细胞培养观察）和体视显微镜（低倍三维成像），光学系统需配置目镜、物镜、聚光镜和光源模块，确保光路同轴性。

电子显微镜技术差异

透射电镜（TEM）通过电子束穿透样本获取超微结构，扫描电镜（SEM）表面形貌成像，需真空环境和电磁透镜系统，分辨率可达纳米级。

特殊光学配置应用

相差显微镜（透明样本相位差成像）、荧光显微镜（激发特定荧光标记）和暗场显微镜（高对比度观察微小颗粒），需匹配对应的滤光片、环形光阑和专用物镜。

光路校准与照明调整

科勒照明校准

调整聚光镜对中旋钮和孔径光阑，使光源灯丝像聚焦于物镜后焦平面，实现均匀照明并减少杂散光干扰，提升成像对比度。

荧光光路校准

确保激发光路与发射光路分离，精确调节二向色镜角度和荧光滤块位置，避免信号串扰，同时优化曝光时间以保护样本光漂白。

激光共聚焦校准

校准激光扫描单元与PMT探测器同步性，调整针孔大小以控制光学切片厚度，平衡信噪比与分辨率需求。

物镜选择与分辨率控制

物镜参数匹配

根据样本厚度和观察尺度选择干镜（10×-40×）或油镜（100×，NA≥1.25），注意校正环调节以补偿盖玻片厚度误差（通常0.17mm）。

多模态物镜应用

水镜（活细胞长工作距离）和红外物镜（深层组织成像）需配套校正环和浸液介质，避免球差影响成像质量。

分