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高效液相色谱（HPLC）培训课件

第一章液相色谱基础概述

液相色谱的起源与发展历史里程碑1906年，俄国植物学家米哈伊尔·茨维特在研究植物色素时首次提出色谱法概念。他用碳酸钙作为吸附剂，成功分离了叶绿素，开创了色谱分析的先河。这一革命性发现为后续分离技术的发展奠定了基础。

液相色谱的分离原理吸附作用组分分子与固定相表面发生物理或化学吸附，极性差异导致保留时间不同分配作用组分在固定相和流动相之间按一定比例分配，疏水性强的组分在非极性固定相中保留更久离子交换带电离子与固定相上的反离子发生可逆交换，实现离子性物质的高效分离排阻效应根据分子大小进行分离，大分子无法进入孔隙快速洗脱，小分子深入孔隙保留时间长

HPLC的特点与优势1高压高效输液泵产生150~300kg/cm2的高压，推动流动相快速通过填料紧密的色谱柱，大幅提升分离效率和柱效2快速分析样品分离通常在15~30分钟内完成，相比传统液相色谱数小时的分析时间，效率提升显著，适合批量检测3超高灵敏度紫外检测器的检测限可达0.01ng级别，荧光检测器灵敏度更高，能够检测痕量物质，满足药物、环境样品等严格要求4卓越柱效

第二章HPLC系统组成与功能

HPLC系统的主要组成部分输液泵提供稳定高压流动相输送进样器精确定量样品引入色谱柱组分分离的核心单元检测器捕获并转化分离信号数据系统采集分析色谱数据

输液泵详解柱塞往复泵的技术优势柱塞往复泵是HPLC系统中最常用的输液装置，通过精密柱塞的往复运动产生脉动流。其核心优势在于流量稳定性极高，能够承受高达400kg/cm2的系统压力，满足高效分离的苛刻要求。双泵系统的创新双泵系统通过两个泵头交替工作，有效减少流量脉冲，将流量重现性提升至RSD0.5%的卓越水平。这种设计不仅提高了分析精度，还增强了梯度洗脱的稳定性。维护要点使用0.2μm滤膜过滤所有流动相，防止固体颗粒损坏单向阀和柱塞密封圈避免使用含盐缓冲液长时间停泵,防止泵内盐结晶造成堵塞

进样器类型与应用隔膜进样器通过注射器穿透硅橡胶隔膜进样，操作简便灵活。但耐压能力有限（通常50kg/cm2），且隔膜易磨损影响密封性，主要用于低压或制备色谱系统。停流进样器暂停泵的运行,在常压下注入样品,然后恢复流动相输送。避免了高压下进样的操作难度,适合制备色谱或大体积样品引入,但会中断分离过程,影响分析速度。六通阀进样器

色谱柱结构与填料色谱柱结构柱管材料：316不锈钢,耐腐蚀、耐高压柱长：10~30cm,长柱提供更高分离度内径：2.1~4.6mm,窄径柱节省溶剂,宽径柱适合制备柱温控制：通常25~60°C,提高分离重复性填料类型硅胶基键合相：C18（ODS）、C8、C4、苯基柱等极性键合相：氨基柱、氰基柱、二醇基柱离子交换填料：强/弱阳离子交换、强/弱阴离子交换手性填料：分离对映异构体

检测器类型与原理紫外-可见检测器（UV-VIS）原理：基于Lambert-Beer定律,测量样品对特定波长光的吸收特点：应用最广,灵敏度高（ng级）,线性范围宽适用：具有紫外吸收的有机化合物（芳香族、共轭体系等）二极管阵列检测器（DAD）原理：同时检测多个波长,获取三维色谱图（时间-波长-吸光度）特点：可进行光谱扫描和峰纯度分析,鉴别共洗脱组分适用：复杂样品分析、未知物鉴定、方法开发荧光检测器（FLD）原理：激发光照射样品,测量发射荧光强度特点：灵敏度极高（pg级）,选择性强适用：生物样品（蛋白质、核酸）、衍生化分析蒸发光散射检测器（ELSD）原理：流动相蒸发后,非挥发性组分颗粒散射光特点：通用型检测器,不依赖发色团适用：糖类、脂质、聚合物等无紫外吸收物质电导检测器（CD）原理：测量溶液电导率变化特点：对离子灵敏度高,背景干扰低

第三章色谱分离模式与应用

反相液相色谱（RPC）分离机制固定相为非极性键合硅胶（C18、C8最常用）,流动相为极性高的水-有机溶剂混合物（甲醇、乙腈）。非极性或弱极性化合物在非极性固定相上保留时间长,极性化合物快速洗脱。应用范围反相色谱是HPLC中应用最广泛的模式,占所有应用的70%以上。适合药物分析、天然产物研究、环境监测、食品检测等众多领域。

正相液相色谱（NPC）分离原理固定相极性高（硅胶、氰基、氨基、二醇基键合相）,流动相为非极性有机溶剂（正己烷、庚烷等）。极性化合物在极性固定相上保留强,非极性化合物快速洗脱。适用范围主要用于强极性化合物分离：酚类、醇类、胺类、氨基酸、糖类、水溶性维生素等。对于这些在反相色谱中保留弱或不保留的物质,正相色谱提供了有效的分离手段。互补性正相与反相色谱的选择性完全不同,形成互补关系。当一种模式无法获得满意分离时,切换到另一种模式往往能解决问题。这种互补性在方法开发中非常重要。

离子交换色谱（IEC）阳离子交换色谱固定相带负电荷（如磺酸基-SO?