05蛋白质的纯化分离与表征.pptVIP

在变性条件下,蛋白质主要根据其质量大小而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中被分离将蛋白质混合物首先溶于SDS(十二烷硫酸钠)的溶液中,SDS是一种阴离子去污剂,它能破坏蛋白质的次级键SDS结合于蛋白质分子上,结合量基本与蛋白质的分子量成正比在垂直平板电泳时,大的蛋白质在上面,而小的蛋白质在下面经过显色反应(与考马斯亮蓝或氨基黑反应)能清晰地呈现被分离的各个蛋白质条带SDS酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化含量与纯度小结其他方法一般原则大小分离溶解度分离电荷分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳由于SDS的条带是按分子量大小从上到下排列的因此未知蛋白与标准梯度分子量的系列条带比较就可以弄清其分子量SDS酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化含量与纯度小结其他方法一般原则大小分离溶解度分离电荷分离SDS可以测定未知蛋白的分子量第一次电泳加的样品是含有梯度pI的多种两性电解质的混合物电泳结果是在凝胶上形成pH梯度区带第二次再加蛋白质混合物样品进行电泳当某个蛋白质走到和自己的等电点相同pH的区域时就停止移动结果蛋白质混合物被分离,并能通过测定pH确定蛋白质的pI等电聚焦IEF酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化含量与纯度小结其他方法一般原则大小分离溶解度分离电荷分离既可分离蛋白质又能测定等电点等电梯度质量梯度等电聚焦+SDS酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化含量与纯度小结其他方法一般原则大小分离溶解度分离电荷分离具有极高分辨率的组合电泳双向电泳=IEF+SDS大肠杆菌的一千多种蛋白质可用双向电泳在一次实验中分开等电聚焦+SDS酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化含量与纯度小结其他方法一般原则大小分离溶解度分离电荷分离具有极高分辨率的组合电泳带有负电荷的固相聚合物球大的正电荷分子小的正电荷分子小的负电荷分子大的负电荷分子蛋白质混合物加入到交换柱上并与阳离子交换离子交换层析蛋白质按照在相应pH条件下所带电荷的不同而以不同的速率向下移动带有更多负电荷的蛋白质以更快的速率被洗脱分段收集渗出液,实现蛋白质的分离离子交换层析酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化含量与纯度小结其他方法一般原则大小分离溶解度分离电荷分离亲合层析利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(生物学亲合力)分离蛋白质的方法能与配体结合的蛋白质被最后洗出不能结合的蛋白质更快地被洗出蛋白质混合物配体溶液亲合蛋白配体配体吸附微球吸附的蛋白质被配体交换洗出蛋白质混合物加入到含特定配体的柱上不能与配体吸附的蛋白质流出更多分离方法详见课本离子交换层析酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化含量与纯度小结一般原则大小分离溶解度分离电荷分离其他方法蛋白质的含量测定蛋白质总量测定凯氏定氮法、folin-酚试剂法、双缩脲法紫外吸收法、燃料结合法、胶体金法特定蛋白质测定酶活性测定、激素活性测定抗原-抗体反应蛋白质的纯度鉴定电泳沉降HPGE毛细管电泳含量测定与纯度鉴定酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化小结含量与纯度在无其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离的质子数等于质子受体结合的质子数时溶液的pH值，称为该蛋白质的等离子点换言之，在无其他盐类存在时，此时蛋白质的等电点称为等离子点等离子点是蛋白质可能的众多pI中的其中一个与蛋白质可能存在多个pI不同，一种蛋白质等离子点是唯一的，因此等离子点是蛋白质的特征性常数蛋白质的等离子点酸碱性质概述分子量测定沉淀分离纯化小结含量与纯度假定某个蛋白质由2个氨基酸A和B组成,其中氨基酸A(占总质量的40%)分子量为400,氨基酸B(占总质量的60%)分子量为600,这个蛋白质的分子量为1000.则氨基酸A的分子量=蛋白质的分子量×氨基酸A的百分比含量蛋白质的分子量=氨基酸A分子量/氨基酸A的百分比含量=400/0.4=1000分子量计算酸碱性质概述分子量测定