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基于SSH技术的小麦抗条锈病新基因材料cDNA文库构建与筛选探索

一、引言

1.1研究背景与意义

小麦作为全球最重要的粮食作物之一，为人类提供了主要的碳水化合物来源，在保障粮食安全方面发挥着举足轻重的作用。然而，小麦生产面临着众多生物和非生物胁迫的挑战，其中小麦条锈病是一种极具破坏力的全球性真菌病害，严重威胁着小麦的产量与质量。

小麦条锈病由条形柄锈菌小麦专化型（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）引起，具有传播速度快、流行范围广、危害程度大等特点。条锈病菌的夏孢子可借助风力进行远距离传播，在适宜的温湿度条件下，能够迅速侵染小麦植株，导致病害大规模爆发。在我国，小麦条锈病主要发生在西北、西南、华北等冬麦区以及东北春麦区，尤其在甘肃、四川、陕西等地，由于独特的地理环境和气候条件，常常成为条锈病的重灾区。

小麦条锈病对小麦的危害是多方面的。从生理角度来看，病菌侵染小麦叶片后，会在叶片上形成鲜黄色的夏孢子堆，这些孢子堆会破坏叶片的组织结构，导致叶片气孔功能失调，影响光合作用和呼吸作用的正常进行。研究表明，感染条锈病的小麦叶片，其光合作用效率可降低30%-50%，从而使得小麦植株生长发育受阻，分蘖减少，成穗率降低。从产量角度而言，条锈病会严重影响小麦的灌浆过程，导致麦粒干瘪，千粒重下降。在病害大流行年份，小麦产量损失可达40%以上，甚至绝收，这不仅给农民带来了巨大的经济损失，也对国家的粮食安全构成了严重威胁。此外，染病小麦的品质也会显著下降，蛋白质含量降低，面筋质量变差，影响面粉的加工性能和食品品质，进而降低小麦的市场价值。

目前，对于小麦条锈病的防治，主要采取化学防治、农业防治和抗病品种选育等措施。化学防治虽然能够在短期内有效控制病害的发展，但长期大量使用化学农药，不仅会增加生产成本，还会导致环境污染和农产品农药残留超标等问题，同时也会使病菌产生抗药性，降低防治效果。农业防治措施如合理密植、轮作倒茬、加强田间管理等，虽然对病害有一定的抑制作用，但难以从根本上解决问题。因此，选育和推广抗病品种被认为是防治小麦条锈病最经济、有效和环保的措施。

然而，由于条锈病菌生理小种变异频繁，新的致病小种不断出现，使得许多原本具有抗性的小麦品种在推广种植数年后就丧失了抗性，这给抗病品种的选育工作带来了极大的挑战。为了培育出具有持久抗性的小麦新品种，深入研究小麦抗条锈病的分子机制，挖掘和克隆新的抗条锈病基因显得尤为重要。

构建小麦抗条锈病新基因材料的SSHcDNA文库，是研究小麦抗条锈病分子机制的关键步骤。抑制差减杂交（SSH）技术能够高效地富集在抗病过程中差异表达的基因，通过构建SSHcDNA文库，可以获得大量与抗条锈病相关的基因序列。对这些基因进行深入研究，有助于揭示小麦与条锈病菌互作的分子机理，为小麦抗条锈病基因工程育种提供理论依据和基因资源。同时，通过对文库中的基因进行筛选和功能验证，能够发现具有潜在应用价值的抗条锈病基因，为培育抗病新品种奠定基础。因此，本研究对于保障小麦安全生产、提高小麦产量和品质、维护国家粮食安全具有重要的理论意义和实践价值。

1.2国内外研究现状

在小麦抗条锈病基因挖掘方面，国内外科研人员开展了大量的研究工作。截至目前，已经在小麦及其近缘物种中鉴定和定位了众多抗条锈病基因。例如，中国科学院遗传与发育生物学研究所凌宏清团队联合西北农林科技大学康振生和韩德俊团队，在全球尺度上构建小麦条锈病“综合抗源”核心资源库，利用全基因组关联荟萃分析，绘制出首张包含431个QTL位点的小麦基因组抗条锈病基因全景图，并筛选获得559个与抗条锈病相关的候选基因，明确了抗病基因在各个锈病流行区的分布和利用规律。山东农业大学吴佳洁团队历经十年，从小麦D基因组祖先节节麦中获得抗条锈病基因YrAS2388（国际编号Yr28），该基因具有独特的结构和抗病机制，通过调整不同转录本的富集水平和编码蛋白的互作模式来应对病原菌侵染。此外，在国外，研究人员也克隆了多个重要的抗条锈病基因，如Yr1、Yr2等，并对其功能和作用机制进行了深入研究。

在文库构建技术方面，随着分子生物学技术的不断发展，文库构建方法日益成熟和多样化。传统的cDNA文库构建方法如λ噬菌体载体法、质粒载体法等，虽然能够构建文库，但存在着假阳性高、基因表达丰度差异大等问题。近年来，抑制差减杂交（SSH）技术因其能够高效富集差异表达基因，在构建文库中得到了广泛应用。例如，有研究利用SSH技术构建了小麦条锈菌诱导的抗病与感病近等基因系的消减文库，通过筛选文库获得了多个差异表达基因，其中包括与信号传导和抗病防御相关的基因。此外，还有基于高通量测序技术的文库构建方法，如RNA-Seq文库构建，