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基于SiDGAT1基因的大豆种子特异表达转基因新种质创制与解析

一、引言

1.1研究背景与目的

大豆作为全球重要的粮食与经济作物，在油脂、蛋白质生产及动物饲料等领域应用广泛。近年来，随着人们生活水平的提高和全球人口的增长，对大豆油脂的需求呈现出持续上升的趋势。高油大豆不仅能够为油脂加工产业提供更丰富的原料，提高油脂产量，还能在一定程度上提升大豆的经济价值和市场竞争力。据相关数据显示，全球大豆油脂市场在过去几十年间保持着稳定的增长态势，对高油大豆的需求日益迫切。然而，目前我国大豆含油量普遍较低，平均含油量约为20%，与国际先进水平相比存在一定差距。传统的大豆育种方法虽然在提高大豆产量和品质方面取得了一定的成果，但在提高大豆含油量方面进展相对缓慢。这主要是因为大豆含油量是一个受多基因控制的数量性状，遗传改良难度较大，且传统育种方法周期长、效率低，难以满足快速增长的市场需求。

随着现代生物技术的飞速发展，转基因技术为大豆遗传改良提供了新的途径。通过转基因技术，可以将特定的基因导入大豆基因组中，实现对大豆性状的定向改良。二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是三酰甘油（TAG）合成途径的限速酶，在植物油脂合成过程中起着关键作用。其中，SiDGAT1基因具有独特的功能和特性，对其进行研究和利用有望为提高大豆含油量提供新的策略。因此，本研究旨在通过转基因技术，将SiDGAT1基因导入大豆中，实现该基因在大豆种子中的特异表达，从而创制出高油大豆新种质，为大豆育种和油脂产业的发展提供技术支持和种质资源。

1.2国内外研究现状

在大豆遗传转化体系方面，经过多年的研究和探索，已经取得了一定的进展。农杆菌介导的遗传转化是目前应用较为广泛且有效的大豆遗传转化方法之一，其具有转化效率相对较高、可导入较大片段外源DNA且遗传稳定性较好等优点。然而，该方法仍存在一些技术瓶颈，如转化效率受多种因素制约、不同大豆品种之间转化效率差异较大等。例如，大豆基因型对外植体的再生能力、对农杆菌侵染的敏感性以及与外源基因整合的效率等方面都存在显著影响，一些大豆品种具有较强的再生能力和较高的转化效率，如“Jack”等品种，而另一些品种则较难转化，如某些地方品种或野生大豆资源。为了提高大豆遗传转化效率，研究人员不断优化转化条件，包括外植体的选择与预处理、农杆菌菌株与载体构建、共培养条件以及筛选与再生体系等方面。例如，通过选择合适的外植体类型，如子叶节、胚尖、未成熟子叶等，并对其进行适当的预处理，如在含特定激素的培养基上预培养一段时间，可以促进细胞分裂和组织的敏感性，使外植体更易接受农杆菌的转化。同时，构建合适的载体，选择合适的启动子、筛选标记基因等调控元件，也有助于提高转化效率和目的基因的表达水平。

在植物启动子的研究方面，启动子是基因表达调控的重要元件，它能够决定基因在何时、何地以及以何种水平表达。目前，已经鉴定和克隆了多种植物启动子，包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子等。组成型启动子如CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子等，能够在植物的各个组织和发育阶段持续表达，但其表达缺乏特异性，可能会对植物的生长发育产生一定的负面影响。组织特异性启动子则能够使基因在特定的组织或器官中表达，如种子特异表达启动子能够使基因在种子中高效表达，而在其他组织中表达量较低或不表达。这不仅可以提高目的基因在特定组织中的表达水平，还可以减少对植物其他组织和器官的影响。因此，种子特异表达启动子在植物基因工程中具有重要的应用价值，为实现基因的精准表达提供了有力的工具。

在植物二酰甘油酰基转移酶（DGAT）的研究方面，DGAT是催化三酰甘油合成途径最后一步反应的限速酶，对植物油脂的合成和积累起着关键作用。在植物中已发现了3种不同类型的DGAT基因，分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3。其中，DGAT1基因家族只存在于动物和植物中，高等植物DGAT1蛋白的氨基酸残基数一般在480-550之间，不同物种的DGAT氨基端前100个氨基酸残基相似性较低，而位于100以后的氨基酸残基相似性较高，可能正是这种N端差异导致了不同植物DGAT1酶属性的不同。一般情况下，植物DGAT1具有9-10个跨膜结构域，在N端有一个由100多个氨基酸组成的亲水域，该亲水域位于内质网膜的胞质面。已有研究表明，过表达DGAT1基因能够显著提高植物种子的含油量。例如，将来自高油植物斑鸠菊的VgDGAT1A基因在大豆种子中特异超表达，连续选择获得高代（T7）VgDGAT1A转基因大豆株系，转基因株系在大豆种子发育中期（30-45DAF），VgDGAT1A高表达，相应地DGAT酶活性是非转基因野生