8.6免疫标记技术.pptVIP

抗原：能刺激机体免疫系统诱导免疫应答并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。

一个完整的抗原应包括两方面的免疫性质：

①免疫原性指诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原；

;②反应原性指抗原与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力，亦称为反应原性。有些物质在独立存在时只具有反应原性而无免疫原性，称为半抗原；而免疫原通常同时具有免疫反应能力。

;抗体：抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。

;抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。;免疫应答：是机体免疫系统对抗原刺激所产生的以排除抗原为目的的生理过程。这个过程是免疫系统各部分生理功能的综合体现，包括了抗原递呈、淋巴细胞活化、免疫分子形成及免疫效应发生等一系列的生理反应。

通过有效的免疫应答，机体得以维护内环境的稳定

;免疫标记技术;荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。是以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术。

是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。

;一、基本原理

利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。;荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。

标记方法：搅拌法(适合大样品)

透析法(适???小样品)

标记抗体的纯化：透析法

层析分离法;2.荧光抗体的鉴定;F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P＝2.4为宜。

抗体效价：效价越大标记抗体的特异性越高，非特异荧光越少。效价在1:16-1:32者较为理想

抗体特异性：免疫电泳和交叉免疫电泳观察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照射下发出强烈荧光

;二免疫荧光显微技术

基本原理：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。;1.标本的制作;;(1)直接法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。;;优点：操作简便、特异性高、非特异荧光染色因素少，

缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体;;

抗原抗原抗体复合物

未标记抗体玻片

抗原抗体复合物标记抗体双抗体复合物;优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。;(3)补体结合免疫荧光法：

此法是在间接法的第一步抗原—抗体反应时加入补体，使之与抗原——抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。

优点：具有间接法的一些优点。

缺点：非特异性荧光更多。

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抗原+抗体+补体复合物

抗原抗体补体

抗原+抗体+补体复合物抗补体标记抗体荧光标记补体复合物;3.荧光显微镜检查;免疫荧光显微技术;是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。;2.基本特点：

①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性

②酶促反应专一性，保证特异性

③底物反应放大作用，提高敏感性

④酶标试剂保存稳定

⑤操作简便，安全易行

;3.酶免疫技术的分类

均相酶免疫测定

酶免疫测定