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志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体制备及其特性研究

一、引言

1.1研究背景与意义

仔猪水肿病是一种对养猪业危害严重的疾病，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。它主要由产Vero细胞毒素大肠杆菌（VTEC）引发，是一种急性致死性传染病。该病发病迅猛，仔猪患病后死亡速度快，往往来不及进行有效治疗，死亡率居高不下，通常可达90%。患病仔猪会出现四肢麻痹、步态蹒跚、痉挛和昏迷等典型神经症状，解剖可见胃壁和肠系膜水肿，故而得名“水肿病”。

研究证实，产Vero细胞毒素大肠杆菌的两个关键致病因子——F18ab（F107）菌毛与志贺样毒素II型变异体（SLT-IIe），与该病的发生紧密相关。其中，SLT-IIe在致病过程中发挥着主要的毒力作用。SLT-IIe属于AB5型毒素，由一个具有酶活性的A亚基和五个能够与细胞表面受体结合的B亚基组成。B亚基在毒素与宿主细胞的识别和结合过程中起着不可或缺的作用，它能够特异性地识别并结合宿主细胞表面的受体，从而介导毒素进入细胞，引发一系列病理反应。

单克隆抗体具有高度特异性、均一性和高亲和力等优点，在疾病的诊断、治疗和研究中具有广泛的应用前景。制备针对志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基的单克隆抗体，对于深入研究仔猪水肿病的发病机制具有重要意义。通过单克隆抗体，能够精准地识别和定位SLT-IIe在体内的作用靶点和作用途径，进一步揭示其致病的分子机制。在疾病诊断方面，单克隆抗体可用于开发高灵敏度、高特异性的检测方法，实现对仔猪水肿病的早期快速诊断，为及时采取防控措施提供有力支持。在治疗领域，单克隆抗体有可能成为一种新型的治疗手段，通过中和毒素的活性，阻断其对宿主细胞的损伤，为仔猪水肿病的治疗提供新的思路和方法。因此，开展志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体的制备研究，对于有效防控仔猪水肿病、减少其对养猪业的危害具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

国外对于志贺样毒素Ⅱ型变异体的研究开展较早，在毒素的结构、功能以及致病机制等方面取得了一系列重要成果。早期研究就已明确了SLT-IIe的基本结构组成，即由A亚基和B亚基构成，并对其作用机制有了初步的认识。在单克隆抗体制备方面，国外科研人员率先利用杂交瘤技术，成功制备出针对SLT-IIe的单克隆抗体，并将其应用于毒素的检测和致病机制的研究。这些研究为后续的相关工作奠定了坚实的理论基础。

国内在这一领域的研究起步相对较晚，但近年来发展迅速。众多科研团队积极投入到相关研究中，在SLT-IIe的基因克隆、表达以及单克隆抗体制备等方面取得了显著进展。例如，有研究运用PCR技术成功扩增了SLT-IIeB基因，并将其克隆到原核表达载体中进行高效表达，通过亲和层析等方法纯化得到了高纯度的SLT-IIeB蛋白，为单克隆抗体的制备提供了优质的免疫原。在此基础上，利用细胞融合技术将小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合，经过筛选和亚克隆，获得了多株能稳定分泌针对SLT-IIeB亚基单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对这些单克隆抗体的特性进行了深入研究。

然而，现有研究仍存在一些不足之处。在单克隆抗体的制备过程中，部分方法存在操作复杂、成本高昂的问题，限制了其大规模应用。一些单克隆抗体的亲和力和特异性还有提升空间，这可能影响其在诊断和治疗中的效果。在单克隆抗体的应用研究方面，虽然已开展了一些探索，但仍不够深入和全面，例如在临床治疗中的应用还处于初步阶段，需要进一步的研究和验证。此外，对于不同地区流行的SLT-IIe毒株，其抗原性可能存在差异，而目前针对这种差异的研究还相对较少，如何制备出能够广泛识别不同毒株的单克隆抗体，也是亟待解决的问题。

1.3研究目标与内容

本研究旨在成功制备出针对志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基的高特异性、高亲和力的单克隆抗体，并对其生物学特性进行全面鉴定。围绕这一目标，研究内容主要包括以下几个方面：

SLT-IIeB基因的扩增与表达：运用PCR技术，从含有SLT-IIe基因的菌株中扩增出B基因片段。通过合理设计引物，确保扩增出的基因序列完整、准确。将扩增得到的SLT-IIeB基因克隆到合适的原核表达载体中，构建重组表达质粒。对重组表达质粒进行测序验证，确保基因序列的正确性。将重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株中，通过优化诱导表达条件，如诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等，实现SLT-IIeB蛋白的高效可溶性表达。

单克隆抗体的制备：以纯化后的SLT-IIeB蛋白作为免疫原，按照合理的免疫程序免疫BALB/c小鼠，使小鼠产生针对该蛋白的免疫应答。在免疫过程中，定期