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基于贝塞尔光束扫描的光片荧光显微技术：原理、进展与应用

一、引言

1.1研究背景与意义

在生物医学成像领域，深入了解生物样本的三维结构和动态过程对于揭示生命现象的本质、疾病的发病机制以及开发有效的治疗方法至关重要。传统的显微镜技术，如宽场荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜，在二维成像和薄样本观测方面取得了显著成果，但在面对三维深组织体成像时存在局限性，难以满足当前生物医学研究对复杂组织结构和功能深入探索的需求。

光片荧光显微技术的出现，为生物医学成像带来了新的突破。该技术采用照明与探测正交的独特方式进行三维图像采集，仅激发焦点处的荧光，有效减少了离焦荧光信号的干扰，降低了光漂白与光毒性，同时减少了背景噪声，极大地提升了成像质量。凭借低光损伤、高采集速率、大视场、体成像等优点，光片荧光显微镜被生物学家广泛应用于胚胎发育、神经科学、肿瘤研究等多个领域，不仅可用于观察细胞和组织的基本结构，还可用于实时监测生物过程中的动态变化，为生物医学研究提供了强大的工具。

然而，生物组织固有的高散射特性仍然是光片荧光显微技术在深层成像中面临的巨大挑战。在观测如大脑或心脏的厚层切片和肿瘤组织等高散射生物样本时，样本内部复杂结构和光学异质性导致光片在样品内产生严重的散射与吸收，进而引起图像模糊或失真。此外，光片荧光显微镜从侧面一次照亮整个平面的照明方式，会使采集的数据中存在条纹伪影，降低图像质量，同时散射会减弱焦点处荧光信号，降低图像对比度，这些问题限制了光片荧光显微技术在深层成像中的应用。

贝塞尔光束作为一种具有独特性质的光束，为解决光片荧光显微技术在深层成像中的问题提供了新的思路。贝塞尔光束在传播过程中能保持较小束腰尺寸，且具备“自我修复”特性，即使在高散射介质中也能保持较长的均匀光片，有效减少对组织内部成像时的畸变。将贝塞尔光束扫描应用于光片荧光显微技术中，有望克服传统光片在深层成像时的局限性，提高成像的分辨率、对比度和穿透深度，为生物医学研究提供更清晰、更准确的三维图像信息，对于推动生物医学领域的发展具有重要的研究价值和现实意义。

1.2光片荧光显微技术概述

1.2.1基本原理

光片荧光显微镜采用照明与探测正交的三维图像采集方式，这种独特的成像方式与传统荧光显微成像技术有着显著的区别。在传统荧光显微成像中，激发光和探测光通常来自同一方向，会激发样本中较大范围的荧光，导致离焦荧光信号干扰严重，成像质量受到影响。而光片荧光显微镜则是利用照明光路从一侧对样品进行照明激发，在与照明光路垂直的方向设置探测光路来探测荧光。

照明光路主要负责光片的形成，其生成的光片厚度对系统的光学切片能力起着决定性作用。常见的光片形成方法主要有两种：一种是通过柱面透镜聚焦形成静态高斯光片；另一种是使用扫描振镜在物镜焦平面快速移动聚焦光束，从而形成动态的虚拟光片，数字扫描光片显微镜（DLSM）便是基于这种原理。静态高斯光片的厚度一般处于几微米到十几微米的范围，它能够提供低光毒性照明，这对于对光敏感的生物样本成像非常有利，能在一定程度上减少光对样本的损伤。然而，其轴向分辨率会受到制约，成像速度相对较慢，并且在照明过程中可能出现不均匀的情况，对于厚样品的成像深度也较为有限。动态光片则将照明能量集中在单线上，可实现更均匀的照明效果，光片厚度可达亚微米级别，这使得系统能够获得更高的轴向分辨率，并且受散射影响较小，成像质量高且速度快。

探测光路在光片荧光显微镜中决定了系统的横向分辨率，并且与光片厚度共同影响着系统的轴向分辨率。当荧光被激发后，探测光路中的物镜负责收集荧光信号，并将其传输到探测器，探测器将光信号转换为电信号或数字信号，最终形成图像。通过精确控制探测光路中的光学元件和参数，可以优化系统的横向分辨率，同时结合合适厚度的光片，实现对样本在轴向方向上的高分辨率成像。

1.2.2技术特点

光片荧光显微技术具有一系列显著的优点，使其在生物医学成像领域中脱颖而出。首先，低光损伤是其重要特性之一。由于采用了选择性照明方式，仅照亮样本的在焦区域，离焦区域不会被激发出荧光信号，这大大减少了光对样本的整体曝光量，降低了光漂白和光毒性，使得长时间观测活体样品成为可能。例如，在胚胎发育研究中，能够对胚胎进行长时间的动态观察，而不会因光损伤影响胚胎的正常发育过程。

高采集速率也是光片荧光显微技术的一大优势。基于面阵探测的宽场成像方式，光片荧光显微镜可以在短时间内获取大量的图像信息，能够满足对快速生物过程的观测需求。在细胞生物学研究中，对于细胞的快速分裂、运动等动态过程，光片荧光显微镜能够实时捕捉并记录，为研究细胞的生命活动提供了有力的工具。

大视场和体成像能力使得光片荧光显微镜可以对较大体积的样本进行成像，获取样本的三维结构信息。在神经科学研究中，能够对整个脑部组织进行成像，有助于研