细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12aDB54T 0574-2026.docxVIP

ICS65.020.30CCSB43

54

西藏自治区地方标准

DB54/T0574—2026

细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12a

2026-1-4发布2026-2-5实施

西藏自治区市场监督管理局发布

I

DB54/T0574—2026

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4仪器材料与试剂 1

5操作方法 2

附录A（资料性）目标扩增序列 4

附录B（资料性）引物及浓度 5

附录C（规范性）PCR反应体系配置 6

附录D（资料性）颜色检测结果判定 7

附录E（资料性）荧光值检测结果判定 8

DB54/T0574—2026

II

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。

本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、佛山大学。

本文件主要起草人：唐文强、黄福强、石斌、赵霞玲、马弘财、罗润波、孙建春、张明珠。

DB54/T0574—2026

1

细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12a

1范围

本文件规定了细粒棘球绦虫CRISPR-Cas12a检测的仪器耗材与试剂、操作方法及结果判定等要求。本文件适用于实验室对细粒棘球绦虫的快速检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

CRISPR-Cas12a

CRISPR全称为ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，中文翻译为“成簇的规律间隔短回文重复序列”，是细菌的适应性免疫系统。Cas全称为CRISPRassociatednuclease，指CRISPR相关核酸酶，Cas12a效应蛋白又称为Cpf1效应蛋白，是一种由可编程RNA引导的DNA核酸酶，属于Ⅱ类V型CRISPR/Cas系统。

细粒棘球绦虫

一种在世界范围内流行的人畜共患慢性寄生虫，属圆叶目（Cyclophyllidea）带科（Taeniidae）棘球属（Echinococcus）绦虫，可引起囊型棘球蚴病（cysticechinococcosis,CE）。

4仪器材料与试剂

仪器

以下仪器用于细粒棘球绦虫样本的保存、灭活和试验处理。

a)实时荧光恒温扩增仪、恒温培养箱等任意一种可以恒温在37℃的仪器；

b)微量移液器（1μL～10μL，20μL～200μL，200μL～1000μL）；

c)掌上离心机：最高转速不小于8000rpm；

d)冷冻式离心机：最高转速不小于15000rpm；

e)涡旋震荡仪；

f)-80°超低温冰箱；

2

DB54/T0574—2026

g)实时荧光恒温扩增仪、荧光定量PCR仪、蓝光照胶仪、验钞灯等任意一种可以实时检测荧光信号或可发出蓝/紫光的仪器设备。

4.2材料

以下材料用于细粒棘球绦虫样本的PCR试验。

a)0.2mL透明顶盖PCR反应管；

b)离心管(1.5mL);

c)一次性移液器吸头；

d)冰盒。

4.3试剂

粪便基因组DNA提取试剂盒，LbCas12a核酸酶，反应缓冲液CleavageBuffer,荧光探针reporter,

RPA试剂盒，阴性质控：ddH?O,阳性质控：含有目标核酸片段的质粒制品，见附录A;crRNA及RPA引物序列及配制的母液浓度见附录B。

5操作方法

5.1生物安全措施

检测过程中不得直接接触待检样品，个人防护及废弃物处置应按照GB19489的规定处理。

5.2样品采集和处理

样品采集和处理应当符合GB19489实验室生物安全通用要求，并遵循以下操作。

a)采集含细粒棘球绦虫组织的病料、细粒棘球绦虫组织/虫卵污染的环境样本或新鲜犬粪200mg~500mg,放