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演讲人：日期:细胞的活性测定

CATALOGUE目录01基本概念与原理02常用检测技术03功能活性测定04应用场景分析05影响因素控制06实验设计与优化

01基本概念与原理

细胞活性定义与意义生物学功能完整性细胞活性指细胞维持正常代谢、增殖和分化等生理功能的能力，是评估细胞健康状态的核心指标，广泛应用于药物筛选、毒性测试和基础研究。疾病模型构建通过测定细胞活性可模拟疾病状态下细胞的病理变化，如肿瘤细胞耐药性研究或神经退行性病变的机制探索。实验质量控制在细胞培养和基因编辑等实验中，活性测定是验证操作是否导致细胞损伤的关键步骤，确保实验数据的可靠性。

测定方法分类依据基于代谢活性如MTT法、CCK-8法通过检测细胞线粒体脱氢酶活性间接反映活细胞数量，适用于高通量筛选但可能受代谢干扰物影响。基于膜完整性台盼蓝染色或LDH释放实验通过检测细胞膜破损情况区分死/活细胞，操作简便但无法区分早期凋亡与坏死。基于荧光标记钙黄绿素-AM/PI双染法结合活细胞酶解荧光生成与死细胞核酸结合特性，可定量分析且灵敏度高，但需荧光显微镜或流式细胞仪支持。

核心检测指标解析氧化应激水平ROS检测试剂盒（如DCFH-DA）量化细胞内活性氧累积程度，反映细胞氧化损伤状态，需注意避光操作以避免假阳性。凋亡与坏死比例AnnexinV-FITC/PI双染可区分早期凋亡（膜磷脂外翻）、晚期凋亡（膜破裂）及坏死细胞，需结合Caspase活性检测验证。增殖率与存活率通过细胞计数或荧光信号计算增殖曲线和存活百分比，需设置空白对照排除背景干扰，尤其关注对数生长期数据。

02常用检测技术

染料排除法台盼蓝染色法通过检测细胞膜完整性判断细胞活性，死细胞因膜通透性增加被染成蓝色，活细胞则拒染。该方法操作简便、成本低，但主观性强且无法区分早期凋亡细胞。双荧光染色（AO/EB）吖啶橙（AO）标记活细胞呈绿色，溴化乙锭（EB）标记死细胞呈红色。能同时区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，适用于形态学观察。碘化丙啶（PI）染色法PI可穿透破损细胞膜与DNA结合，经流式细胞仪定量分析。适用于大规模细胞活性筛查，需结合荧光显微镜或流式细胞术，灵敏度高于台盼蓝。

MTT/MTS比色法MTT被活细胞线粒体脱氢酶还原为紫色甲瓒，溶解后测定OD值。需严格控制孵育时间（通常4小时）和DMSO溶解步骤，避免结晶影响读数。原理与步骤应用场景改良方法广泛用于药物筛选和细胞增殖检测，可高通量分析，但受pH、温度及细胞代谢状态影响较大。MTS法采用水溶性甲瓒产物，省去溶解步骤，更适合自动化检测，但成本较高且灵敏度略低于MTT。

ATP生物发光法反应机制利用荧光素酶催化ATP与荧光素反应发光，发光强度与活细胞ATP含量成正比。检测限可达1个细胞/孔，适用于微量细胞检测。技术优势灵敏度高（比MTT法高10-100倍）、检测速度快（10分钟内完成），特别适合悬浮细胞和原代细胞活性分析。注意事项需严格避光操作，避免ATP酶抑制剂干扰，且试剂稳定性较差，需现配现用。配套仪器需具备化学发光检测功能。

03功能活性测定

增殖能力检测利用5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）掺入新合成DNA的特性，通过免疫荧光或ELISA定量检测增殖细胞比例，尤其适用于细胞周期研究。BrdU标记法????0104????03??02??采用微电极阻抗技术无标记动态监测细胞增殖曲线，可实时反映药物或环境因素对细胞生长的影响。实时细胞分析（RTCA）通过检测线粒体脱氢酶还原黄色MTT染料为紫色甲瓒的能力，间接反映细胞增殖活性，适用于贴壁和悬浮细胞的增殖能力评估。MTT法通过观察单个细胞在适宜条件下形成集落的能力，评估细胞的长期增殖潜能和克隆源性，常用于肿瘤细胞和干细胞研究。集落形成实验

代谢活性分析ATP含量检测01通过荧光素酶反应测定细胞内ATP水平，直接反映细胞的能量代谢状态，常用于评估细胞活力或毒性效应。葡萄糖消耗与乳酸生成02利用生化试剂盒检测培养液中葡萄糖和乳酸浓度变化，间接反映糖酵解活性，适用于代谢重编程研究（如Warburg效应）。氧消耗率（OCR）与细胞外酸化率（ECAR）03采用Seahorse能量代谢分析仪同步测定线粒体呼吸和糖酵解效率，为研究细胞代谢表型提供多维数据。NAD+/NADH比值检测04通过酶循环法或荧光探针测定氧化还原辅酶比例，揭示细胞的氧化还原状态及代谢压力响应机制。

膜完整性评估台盼蓝染色法利用台盼蓝染料选择性渗透死亡细胞膜的特性，通过显微镜或流式细胞术定量活细胞比例，操作简便但需注意染色时间控制。LDH释放实验检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性，反映细胞膜损伤程度，适用于药物毒性或细胞凋亡/坏死评估。钙黄绿素-AM/PI双染钙黄绿素-AM标记活细胞胞质酯酶活性（绿色荧光），碘化丙啶（PI）标记死细胞核（红色