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基因重组的一般步骤

第四节.基因工程载体

第四节.基因工程载体基因工程载体（vector）。承载体外源DNA片段（基因）,并将其带入受体细胞的传递者。基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。目前已构建应用的基因工程载体主要有质粒载体噬菌体载体病毒载体人工构建的组合载体

第四节.基因工程载体用于原核生物宿主的载体(1)1.质粒载体质粒(plasmid)是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从1kb到200kb。质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。质粒DNA的特点为：双链环状；分子量很小；自主或半自主复制；不同生物质粒中的基因种类不同。

第四节.基因工程载体用于原核生物宿主的载体(2)每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。质粒的复制和遗传独立于染色体，但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白质和酶。质粒按其复制方式分为:松驰型质粒:复制不需要质粒编码的功能蛋白，其复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶(如DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ，依赖于DNA和RNA聚合酶等)来进行。严紧型质粒:复制要求同时表达一个由质粒编码的蛋白质。

第四节.基因工程载体用于原核生物宿主的载体(3)从分子量大小看,质粒DNA只占细胞染色体组的一小部分，一般约为1-3%，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。质粒赋予寄主细菌一些额外的特性，包括抗性特征，代谢特征，修饰寄主生活方式等。由质粒DNA编码的基因还包括有产生抗菌素的基因、芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因等等。

DNAcloningusingbacterialplasmidsE.ColichromosomePlasmidPurifyplasmidDNAPurifyhumanDNATreatwithEcoR1tocleavebothhumanandbacterialDNAintodifferentsizedfragmentsInsulingeneIncubateE.colicellsunderconditionswheretheywilltakeupplasmidsfromthemediumPopulationofplasmidscontainingdifferentsegmentsofhumanDNAPlasmidfreeE.coliJoinfragmentsintorecombinantDNAswithDNAligaseRibosomalRNAgene

第四节.基因工程载体用于原核生物宿主的载体(4)质粒载体pUC18/19这对载体由2686bp组成，带有复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子?--半乳糖苷酶基因(lacZ’)的调节片段，一个调节lacZ’基因表达的阻遏蛋白(repressor)的基因lacI，还有多个单克隆位点。由于pUC质粒含有Ampr抗性基因和lacZ’基因，可以通过颜色反应和Ampr对转化体进行双重筛选。

第四节.基因工程载体用于原核生物宿主的载体(7)2.噬菌体(Bacterophage)载体噬菌体噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的DNA，最常见的是双链线形DNA,且感染率高。0.02-0.3?m

第四节.基因工程载体用于原核生物宿主的载体(8)噬菌体的形态

第四节.基因工程载体SARS冠状病毒果子狸

第四节.基因工程载体噬菌体的生命周期VirusattachedtocellVirusDNAinjectedintocellVirusDNAremainsseparatedfromhostchromosomeVirusDNAintegratedintothehostchromosomeBacteriareproducedwithintegratedprovirusLysogenicpathwayLyticpathwayVirusreleasedascelllysisVirusparticlesassembledHostDNAdegraded,VirusDNAandproteinsynthesized

第四节.基因工程载体用于原核生物宿主的载体(9)?噬菌体的cos末端COS5’-CGGGGC