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生物化学葡萄糖检测实验教案

一、实验名称

葡萄糖的定量检测——邻甲苯胺法

二、实验目的

1.掌握邻甲苯胺法测定葡萄糖含量的基本原理和操作技术。

2.熟悉分光光度计的工作原理并能正确使用。

3.学会制作标准曲线，并能运用标准曲线对未知样品进行定量分析。

4.理解血糖测定的生理意义，初步判断实验样品中葡萄糖的含量水平。

三、实验原理

葡萄糖是一种己醛糖，在酸性条件下，可与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的席夫碱（Schiffsbase）。该产物在特定波长（通常为630nm左右）处有最大吸收峰，其吸光度与葡萄糖浓度在一定范围内呈线性关系。通过测定标准葡萄糖溶液的吸光度，绘制标准曲线，再根据未知样品的吸光度，即可从标准曲线上查出其葡萄糖浓度。

本方法特异性较高，干扰物质较少，反应灵敏，适用于血清、血浆、脑脊液等生物样品中葡萄糖的定量测定。

四、实验材料与试剂

（一）实验材料

1.标准葡萄糖溶液：浓度为已知的标准品。

2.待测样品：如血清、尿液、或其他生物体液（根据教学安排可选用模拟样品或真实样品，若使用真实样品需注意生物安全）。

3.蒸馏水或去离子水。

（二）实验试剂

1.邻甲苯胺试剂：由邻甲苯胺、冰醋酸及硫脲等成分组成。此试剂具有毒性和腐蚀性，操作时需小心，并在通风橱内进行。

2.葡萄糖标准储存液：精确配制的高浓度葡萄糖溶液。

3.葡萄糖标准应用液：由标准储存液稀释而成，浓度适宜作标准曲线用。

（三）实验仪器与器材

1.分光光度计

2.恒温水浴锅

3.试管及试管架

4.移液管（不同规格）

5.容量瓶（不同规格）

6.烧杯、滴管、洗耳球

7.记号笔、坐标纸或电脑（用于绘制标准曲线）

五、实验步骤

（一）准备工作

1.检查所需仪器是否正常工作，分光光度计预热。

2.恒温水浴锅调至规定温度（通常为100℃或其他特定温度，具体根据试剂说明书确定）。

3.仔细阅读试剂瓶标签，确认所用试剂无误，并检查试剂是否在有效期内。

4.准备好洁净的试管，用记号笔编号。

（二）标准曲线的制作

1.取若干支洁净试管，分别标记为“空白管”、“标准管1”、“标准管2”、“标准管3”、“标准管4”等（根据标准品浓度梯度设置）。

2.按照下表依次向各管中加入试剂：

试管编号

蒸馏水(mL)

葡萄糖标准应用液(mL)

邻甲苯胺试剂(mL)

------------

-------------

-----------------------

-------------------

空白管

0.1

0

5.0

标准管1

0

0.05

5.0

标准管2

0

0.1

5.0

标准管3

0

0.2

5.0

标准管4

0

0.3

5.0

...

...

...

...

*（注：具体加入体积和浓度梯度可根据实际情况调整，确保标准曲线覆盖未知样品可能的浓度范围。）*

3.各管加样完毕后，轻轻混匀。

4.将所有试管同时放入已预热至规定温度的恒温水浴锅中，准确计时，保温一定时间（通常为10-15分钟）。

5.保温结束后，立即将试管取出，放入冷水中冷却（或室温放置），使反应终止。

（三）未知样品的测定

1.另取若干支洁净试管，标记为“样品管1”、“样品管2”等（根据样品数量而定，可做平行实验）。

2.向每支样品管中加入待测样品溶液0.1mL（若样品浓度过高，需进行适当稀释，并记录稀释倍数），再加入邻甲苯胺试剂5.0mL，混匀。

3.同样置于上述恒温水浴锅中保温相同时间，取出后冷却。

（四）吸光度测定

1.打开分光光度计，预热并调试。选择波长630nm（或根据试剂说明书推荐波长）。

2.以空白管溶液作为参比，调节分光光度计的吸光度为零。

3.依次测定各标准管和样品管溶液的吸光度（A值），记录数据。测定前需将试管内溶液混匀。

六、数据记录与处理

1.数据记录：设计表格记录各标准管的葡萄糖浓度（或加入量）及其对应的吸光度A值，以及各未知样品管的吸光度A值。

2.标准曲线绘制：

*以各标准管的葡萄糖浓度（mmol/L或mg/dL）为横坐标（X轴）。

*以其对应的吸光度A值为纵坐标（Y轴）。

*在坐标纸上描点，并用直尺绘制一条通过原点的最佳拟合直线，此即为标准曲线。或使用计算机软件（如Excel）进行线性回归分析，得到回归方程Y=aX+b（理想状态下b应接近0）。

3.未知样品浓度计算：

*根据未知样品管的吸光度A值，在标准曲线上查出其对应的葡萄糖浓度，或代入回归方程计算。

*若样品进行了稀释，需将计算结果乘以稀释倍数，得到样品中葡萄糖的实际浓度。

七、注意事项

1.试剂安全：邻甲苯胺试剂具有毒性、刺激性和腐蚀性，操作时应