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脆皮大头蛙Cathelicidins基因克隆、表达及结构与功能分析

摘要

本研究聚焦于脆皮大头蛙Cathelicidins基因，运用RACE技术成功克隆出相关基因序列，并进行了原核表达。通过生物信息学分析以及抑菌活性检测等实验，深入探究其结构与功能。结果显示，克隆得到的基因序列具有Cathelicidins家族典型特征，原核表达获得的蛋白产物经鉴定正确且具有一定抑菌活性。本研究为进一步理解脆皮大头蛙的免疫防御机制以及新型抗菌药物的研发提供了重要的理论依据。

关键词

脆皮大头蛙；Cathelicidins基因；基因克隆；原核表达；结构与功能

一、引言

1.1抗菌肽概述

抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMPs）是生物体内经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，广泛分布于细菌、真菌、植物、昆虫及动物等不同生物类群中。作为生物体先天性免疫系统的关键组成部分，抗菌肽在抵御病原体入侵过程中发挥着至关重要的作用。相较于传统抗生素，抗菌肽具有抗菌谱广、作用机制独特、不易产生耐药性等显著优势，因而在新型抗感染药物研发领域展现出巨大的潜力，吸引了众多科研人员的关注。

1.2Cathelicidins家族抗菌肽

Cathelicidins是脊椎动物特有的一类重要抗菌肽家族，其前体蛋白通常由N端信号肽、保守的cathelin结构域以及C端高度可变的成熟肽区域构成。在生物体受到病原体刺激时，前体蛋白经酶切作用释放出具有生物活性的成熟肽，进而发挥抗菌、抗炎、免疫调节等多种生物学功能。目前，在哺乳动物、鸟类、爬行动物和鱼类等多个脊椎动物类群中均已发现Cathelicidins家族抗菌肽的存在，并且对其结构与功能的研究也取得了较为丰富的成果。然而，有关两栖动物Cathelicidins家族抗菌肽的研究相对较少，尤其是在脆皮大头蛙这一物种中，相关研究尚处于起步阶段。

1.3脆皮大头蛙的研究意义

脆皮大头蛙（Limnonectesfragilis）隶属于蛙科大头蛙属，主要分布于东南亚及我国南方部分地区。该物种皮肤裸露且湿润，在自然环境中极易受到各种病原体的侵袭。为适应生存环境，脆皮大头蛙在长期进化过程中可能形成了一套独特而有效的免疫防御机制，其中抗菌肽的产生可能是其抵御病原体入侵的重要手段之一。深入研究脆皮大头蛙Cathelicidins基因的结构与功能，不仅有助于揭示该物种的免疫防御机制，还可能为新型抗菌药物的研发提供全新的思路和靶点。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

健康成年脆皮大头蛙，采集于[具体采集地点]，实验前在实验室条件下暂养一周，适应环境后进行后续实验。

2.1.2菌株与载体

大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自[公司名称]；pMD18-T载体、pET-32α(+)表达载体均购自TaKaRa公司。

2.1.3主要试剂

Trizol试剂、逆转录试剂盒、ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、DNA连接酶、DNAMarker、蛋白Marker等均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司；IPTG、氨苄青霉素等购自Sigma公司；其他常规化学试剂均为国产分析纯。

2.2实验方法

2.2.1总RNA的提取与cDNA的合成

采用Trizol试剂提取脆皮大头蛙皮肤组织总RNA，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。提取得到的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并通过紫外分光光度计测定其浓度和纯度。以总RNA为模板，利用逆转录试剂盒合成cDNA第一链，反应体系及条件参照试剂盒说明书进行设置。

2.2.2脆皮大头蛙Cathelicidins基因的克隆

根据GenBank中已登录的两栖类Cathelicidins基因保守序列，设计并合成特异性引物（表1）。以cDNA第一链为模板，利用ExTaqDNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×PCRBuffer25μL，dNTPMix（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板2μL，ExTaq酶0.5μL，ddH?O补足至50μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒回收目的片段，并将其连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过蓝白斑筛选及菌落