医学课件-肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的表达.pptxVIP

医学课件-肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的表达汇报人：XXX2025-X-X

目录1.引言

2.肝癌特异性鼠源单链抗体基因的构建

3.肝癌特异性人源化单链抗体基因的构建

4.单链抗体在大肠杆菌中的表达

5.单链抗体活性检测

6.结果分析

7.讨论与展望

01引言

肝癌的背景与现状肝癌定义及类型肝癌，即肝细胞癌，是全球癌症相关死亡的主要原因之一。根据世界卫生组织的数据，每年约有81万新发肝癌病例，其中男性占比超过70%。肝癌主要分为原发性和继发性两种类型，原发性肝癌主要包括肝细胞癌和胆管细胞癌。肝癌发病原因肝癌的发病原因复杂，主要包括乙型肝炎病毒（HBV）感染、丙型肝炎病毒（HCV）感染、长期酗酒、黄曲霉毒素污染、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等。其中，HBV和HCV感染是导致肝癌的主要危险因素，占所有肝癌病例的60%以上。肝癌诊断与治疗肝癌的早期诊断较为困难，一旦发现多数已处于晚期。目前，肝癌的治疗方法主要包括手术切除、射频消融、化疗、靶向治疗和免疫治疗等。然而，由于肝癌的恶性程度高、转移快，其治疗效果和预后仍然较差。

单链抗体的优势结构简单单链抗体（scFv）仅包含抗体可变区，结构简单，易于基因工程改造和表达，降低了生产成本。与全抗体相比，scFv的分子量更小，便于穿过肿瘤组织，提高药物递送效率。稳定性高scFv具有较好的稳定性，不易发生降解，能够在体内环境中保持活性。此外，scFv的稳定性使其在储存和运输过程中更加方便，减少了药物浪费。易于工程化scFv易于进行结构改造和功能优化，可以通过定向突变、融合等技术提高其亲和力和特异性。此外，scFv可以与其他分子如毒素、放射性同位素等结合，增强其治疗效果。

单链抗体在肝癌治疗中的应用靶向治疗单链抗体在肝癌治疗中主要作为靶向治疗药物，通过特异性结合肿瘤相关抗原，抑制肿瘤细胞生长和扩散。例如，针对表皮生长因子受体（EGFR）的单链抗体在临床试验中显示出良好的抗肿瘤活性。免疫调节单链抗体还可以作为免疫调节剂，激活或抑制免疫系统，增强抗肿瘤免疫反应。例如，针对程序性死亡蛋白-1（PD-1）的单链抗体能够解除肿瘤细胞的免疫抑制，提高治疗效果。联合治疗单链抗体常与其他治疗方法联合应用，如化疗、放疗等，以提高治疗效果。例如，在肝癌治疗中，单链抗体与化疗药物的联合使用能够增强对肿瘤细胞的杀伤力，提高患者的生存率。

02肝癌特异性鼠源单链抗体基因的构建

鼠源单链抗体基因克隆抗原免疫鼠首先，通过免疫小鼠制备针对肝癌特异性抗原的单链抗体。免疫过程中，通常使用高剂量抗原免疫小鼠，诱导产生高亲和力的抗体。免疫周期一般为4-6周。抗体纯化从免疫鼠的血清中纯化出单链抗体，常用的方法包括亲和层析、蛋白质A/G亲和层析等。纯化后的单链抗体纯度需达到95%以上，以确保后续基因克隆的准确性。基因克隆与测序利用RT-PCR技术从血清中提取mRNA，通过逆转录合成cDNA。然后，通过PCR扩增抗体可变区基因，克隆到表达载体中。克隆后的基因需要进行测序验证，确保无突变和错误。

基因片段的组装与优化基因片段连接将克隆得到的抗体可变区基因与载体骨架通过酶切连接，确保正确的阅读框和融合位点。连接效率通常要求超过90%，以保证基因表达载体的成功构建。载体筛选将连接后的基因载体转化到大肠杆菌中，通过蓝白斑筛选法或PCR筛选法挑选阳性克隆。筛选出的阳性克隆需进行鉴定，确保基因片段正确插入载体。表达载体优化根据表达载体的表达效率，可能需要对启动子、终止子等序列进行优化。通过比较不同启动子的表达水平，选择最合适的启动子以提高单链抗体的表达量。

基因表达载体的构建载体选择根据表达系统需求，选择合适的大肠杆菌表达载体，如pET-28a等。载体需包含强启动子、核糖体结合位点、融合标签和终止子等元件，确保高效表达。基因插入通过酶切和连接技术将抗体基因片段插入到表达载体中，确保基因的正确插入和阅读框的保持。连接效率需达到95%以上，以获得稳定的表达克隆。验证与保存对构建的表达载体进行PCR和测序验证，确保基因片段正确插入且无突变。将验证通过的载体保存于-80°C冰箱，为后续表达和纯化做准备。

03肝癌特异性人源化单链抗体基因的构建

人源化抗体设计抗原筛选首先，从肝癌细胞中筛选出具有免疫原性的抗原，通常通过ELISA等技术进行筛选，确保抗原能够激发人体免疫反应。人源化策略采用人源化技术，将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区进行融合，以保留其特异性和亲和力，同时降低免疫原性。常用的策略包括VH区与VH区融合、VH区与VH区融合等。序列优化对人源化抗体进行序列优化，通过定向突变提高其亲和力和特异性，同时减少与人体内其他蛋白的结合，降低潜在的副作用。优化过程可能涉及数千个突变体的筛选。

人源化抗