动物细胞的消化与冻存.docVIP

细胞的消化、传代和冻存

一、实验目的

了解传代细胞的消化方法、传代及冻存的操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及细胞的消化和冻存。

二、实验原理

细胞的消化是利用胰酶将贴壁生长的细胞重新制成单细胞悬液的过种；传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。细胞的冻存是经消化的细胞加入冻存液后，于低温下长期保存的方法。

三、实验用品

1耗材

培养皿、吸管、橡皮头、培养瓶、显微镜、血细胞计数器及血细胞计数板等。

2试剂

磷酸盐缓冲液(PBS)及细胞消化液：含EDTA的0.5％胰蛋白酶.

四、实验步骤

（1）在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成单层；

（2）向培养瓶或培养皿中加入2-3mlPBS，轻轻旋转细胞培养瓶或培养皿，将PBS吸净；

（3）向培养瓶或培养皿中加入1-2ml胰酶，于37℃消化验1-2分钟，并于显微镜下观察细胞的形态变化。

（4）轻轻吸掉消化液（或直接加入5ml，含10%小牛血液的DMEM培养液），加入3-5mlDMEM培养液，利用吸管轻轻吸打直至细胞形成单细胞的悬液。

(5)吸取4ml（培养皿中留1-2ml消化后的细胞悬液）左右细胞悬液移至15亳升离心管中，培养皿或培养瓶中加入DMEM培养液液继续进行传代培养；

（6）于室温下800rpm离心5-10分钟，并轻轻倒掉上清液；

（7）加入含10%FBS和10%二甲亚砜的DMEM培养液，轻轻吸打制成细胞悬液；

（8）将细胞悬液按1ml每管加到细胞冻存管中；

（9）将细胞冻存管放到4度、零下20度和超低温冰箱按程序冻存细胞。

（10）另取少量细胞冻存液，利用血球计数板进行细胞计数。

作业及思考题：

1．简述细胞传代培养的操作程序及注意乡项。

2．细胞消化的时间该如何控制？

3．简述体外培养细胞的形态特征及在胰酶消化后的细胞形态。

4．利用血球计数板对消化的细胞进行计数。