蔗糖异构酶性质改造及枯草芽孢杆菌异源表达的研究与应用.docxVIP

蔗糖异构酶性质改造及枯草芽孢杆菌异源表达的研究与应用

一、引言

1.1研究背景

异麦芽酮糖作为蔗糖的同分异构体，是一种新型功能性甜味剂，在食品、医药等领域展现出广阔的应用前景。其甜度约为蔗糖的42%，具有低吸湿性、低致龋性、低血糖指数等特性，能选择性促进双歧杆菌在人体肠道菌群中的生长，有利于维持肠道微生态平衡，对糖尿病患者和肥胖人群十分友好，美国FDA将其列为公认安全食品，并允许无限量添加到食品生产过程中。然而，天然的异麦芽酮糖含量极低，无法通过提取的方式来满足日渐庞大的市场需求，因此需要采用其他的方法来提高异麦芽酮糖的产量。

目前，异麦芽酮糖的生产方式主要有化学合成法、植物转基因法、微生物转化法及酶转化法。化学合成法和植物转基因法存在工艺复杂、技术不成熟、高能耗、高污染等问题；微生物转化法易受微生物细胞活力和底物浓度限制。相比之下，酶转化法具有反应条件温和、特异性强、效率高和环境友好等优势，成为目前工业上主要采用的方法。该方法主要利用蔗糖异构酶（SucroseIsomerase，SIase,EC5.4.99.11）催化蔗糖生产异麦芽酮糖。蔗糖异构酶能将蔗糖分子内的α-1,2-糖苷键转换成α-1,6-糖苷键的异麦芽酮糖和α-1,1-糖苷键的海藻酮糖，同时还能将蔗糖水解为少量的副产物葡萄糖和果糖。

尽管酶转化法具有诸多优点，但目前天然蔗糖异构酶存在一些不足，限制了其在工业生产中的应用。例如，大多数已报道的野生型蔗糖异构酶稳定性差，在高温或极端pH条件下容易失活，导致酶的使用寿命缩短，增加了生产成本；酶催化活性低，使得蔗糖转化为异麦芽酮糖的效率不高，影响生产效率；此外，反应过程中还会产生较多副产物，增加了后续产物分离和提纯的难度与成本。因此，对蔗糖异构酶进行性质改造，提高其稳定性、催化活性和产物选择性，具有重要的研究意义和实际应用价值。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过对蔗糖异构酶进行性质改造，并实现其在枯草芽孢杆菌中的异源表达，以获得性能优良的蔗糖异构酶，推动异麦芽酮糖的工业化生产。具体而言，通过定点突变、化学修饰等手段对蔗糖异构酶进行改造，期望提高其热稳定性、pH稳定性、催化效率以及对异麦芽酮糖的产物选择性，减少副产物的生成。同时，选择枯草芽孢杆菌作为异源表达宿主，利用其遗传背景清晰、生长迅速、易于培养、蛋白分泌能力强且被公认为安全级（GRAS）菌株等优势，实现蔗糖异构酶的高效表达和分泌，降低生产成本，为异麦芽酮糖的大规模工业化生产奠定基础。

本研究的成果将有助于解决当前蔗糖异构酶在应用中存在的问题，提高异麦芽酮糖的生产效率和质量，降低生产成本，促进异麦芽酮糖在食品、医药等领域的广泛应用。此外，本研究对于丰富酶工程和基因工程的理论与技术，推动相关学科的发展也具有一定的科学意义。

1.3研究内容与方法

本研究主要围绕蔗糖异构酶的性质改造及其在枯草芽孢杆菌中的异源表达展开，具体研究内容与方法如下：

蔗糖异构酶的性质改造：基于蔗糖异构酶的晶体结构和催化机制，利用生物信息学工具分析可能影响酶性质的关键氨基酸位点。采用定点突变技术，对筛选出的关键位点进行突变，构建一系列蔗糖异构酶突变体。通过测定突变体的酶活、热稳定性、pH稳定性、底物亲和力等酶学性质，筛选出性能优良的突变体。同时，运用化学修饰方法，选择合适的化学修饰剂对蔗糖异构酶进行修饰，探究化学修饰对酶性质的影响，优化修饰条件以获得最佳修饰效果。

蔗糖异构酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达：从GenBank等数据库中获取蔗糖异构酶基因序列，根据枯草芽孢杆菌的密码子偏好性对其进行优化。将优化后的基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体上，构建重组表达质粒。采用电转化等方法将重组质粒导入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选阳性转化子。对重组枯草芽孢杆菌进行发酵条件优化，包括培养基成分、培养温度、pH值、诱导剂浓度和诱导时间等，提高蔗糖异构酶的表达量和活性。利用SDS、Westernblot等技术对表达的蔗糖异构酶进行鉴定和分析，确定其表达情况和分子质量。

异麦芽酮糖的制备与分析：以蔗糖为底物，利用改造后的蔗糖异构酶或重组枯草芽孢杆菌发酵液进行异麦芽酮糖的制备反应。通过高效液相色谱（HPLC）、薄层层析（TLC）等分析技术，对反应产物进行定性和定量分析，测定异麦芽酮糖的含量和副产物的种类与含量。探究反应条件如温度、pH值、底物浓度、酶用量等对异麦芽酮糖制备的影响，优化反应条件，提高异麦芽酮糖的转化率和生产效率。

二、蔗糖异构酶的概述

2.1蔗糖异构酶的来源与分布

蔗糖异构酶主要来源于微生物。自1950年首次从甜菜厂废水中筛选出红色精朊杆菌（Protaminobacterrubrum）并发现其可产蔗糖异构酶以来，科研人员陆续发现了多种能合