青霉素的发酵系列实验.docVIP

实验三青霉素的发酵系列实验

实验目的

通过青霉素发酵,对抗生素发酵有一个初步的了解；

掌握抗生素发酵过程中一些重要生理指标的分析方法。

二、实验原理

抗生素产生菌在发酵过程中，利用培养基中的各种营养成分进行一系列的代谢变化，同时分泌出许多的代谢产物。就菌体代谢类型来说，可分为分解代谢产物和合成代谢产物，而合成代谢产物又分为初级代谢产物和次级代谢产物，抗生素就是次级代谢产物中的一类。

抗生素发酵的过程中生成菌株的代谢研究是提高抗生素产量的一个重要环节，很多工作，如生产菌株的选育、新抗生素的研究、菌株营养要求、发酵调节以及工艺设备的改进等，都与菌株的代谢研究密切相关。

三、实验材料与器材

菌种产黄青霉

发酵培养基配方如下:

PDA培养基

马铃薯

200g

琼脂

18~20g

葡萄糖

20g

双蒸水

1L

LB培养基配方

蛋白胨

2g

NaCl

2g

酵母粉

1g

琼脂

3g

金黄色葡萄球菌

器材：不锈钢小杯（牛津小杯），培养皿，移液枪，三角瓶等。

四、实验方法

菌种培养

将产黄青霉3.546接种到察氏琼脂斜面培养基上,26度培养5~6天备用.

发酵

从察氏斜面培养基上移种环青霉菌孢子,接种到三角瓶发酵培养液中,然后将三角瓶置于冰箱保存，每隔24h取出一瓶,放入摇床。

分析、测定

青霉菌效价的测定（单位/mL）抗菌物质的微生物测定方法有稀释法、比浊法以及琼脂扩散法。本实验采用国际上最普遍应用的琼脂平板扩散法来测定青霉素效价。它是将规格一定的不锈钢小管置于带菌的琼脂平板上，管中加入被测液，在室温中扩散一定时间后放入恒温箱培养。在菌体生长的同时，被测液（抗生素）扩散到琼脂平板内，抑制周围菌体的生长或杀死周围菌体，从而产生不长菌的透明抑菌圈。在一定范围内，抗菌物质的浓度（对数值）与抑菌圈直径（数学值）呈直线关系。

金黄色葡萄球菌悬液的制备

取在传代琼脂培养基上连续培养3~4代的金黄色葡萄球菌，用0.85%的生理盐水洗下，离心沉淀，倾去上层清夜，菌体沉淀后再用生理盐水洗1~2次，最后将菌液稀释至18~21亿个/mL。或者用光电比色计测定，透光率为20%（波长在650nm）。

青霉素标准溶液的配制

准确称取纯苄青霉素钠盐15~20g，溶解在一定量的pH6.0的磷酸缓冲液中，使成2000单位/mL的青霉素溶液。然后依次稀释，配制成10单位/mL青霉素标准工作液。我们组稀释的五种浓度分别为800单位/mL，1000单位/mL，1200单位/mL，1500单位/mL，2000单位/mL.

青霉素标准曲线的制备

取灭菌培养皿10个，每个培养皿用大口吸管吸取已冷却的下层培养皿21mL。水平放置，带凝固后，再加入上层培养基4mL，将培养皿来回倾侧，使含菌的上层培养基均匀分布。上层培养基在使用前先冷却至50度左右，每100mL培养基加入50%葡萄糖溶液1mL及金黄色葡萄球菌悬液3~5mL，充分摇匀，在50度水浴内放置10min后使用。青霉素溶液的抑菌圈大小与上层培养基内菌体的浓度密切相关。增加细菌浓度，抑菌圈就缩小。试验中加入菌体的量应控制在1单位/mL青霉素溶液的抑菌圈直径在20~24nm之间。

7．待上层培养基完全凝固后，在每个琼脂平板上轻轻放置牛津小杯3个，小杯之间的距离应该相等，然后用枪将青霉素标准溶液加入小管中，每一浓度做2个平行。盖上培养皿盖，将培养皿移至37度恒温箱内培养18~24h后，移去小管，精确滴量取抑菌圈直径并记录数据。

8.将摇床上的五瓶三角瓶发酵培养液拿出来，根据步骤7操作，24h后测量其五天的抑菌圈浓度，并根据标准曲线计算出其五天的青霉素浓度。

8.计算

计算每种抑菌圈的平均直径，以青霉素浓度（单位/mL）的对数值为纵坐标，以抑菌圈直径的校正值（nm，数学值）为横坐标，绘制标准曲线。将1~5天检品稀释液抑菌圈直径的校正值在标准曲线上分别查出各检品稀释液的效价。

五、结果与讨论

1、青霉素标准曲线

图一青霉素