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ChiRip双价基因对大豆的遗传转化及转基因株系的培育

一、研究背景

大豆作为重要的粮食作物和油料作物，在农业生产中占据着举足轻重的地位。然而，大豆在生长过程中面临着多种病虫害的威胁，这不仅会导致大豆产量大幅下降，还会影响大豆的品质。传统的防治方法往往效果有限，且可能对环境造成负面影响。

随着基因工程技术的不断发展，通过遗传转化将抗病虫基因导入大豆，培育具有优良抗病虫特性的转基因大豆品种，成为解决大豆病虫害问题的有效途径。几丁质酶（Chi）基因和核糖体失活蛋白（Rip）基因是两种重要的抗病虫基因。几丁质酶能够分解许多真菌细胞壁的主要成分几丁质，从而抑制真菌的生长繁殖；核糖体失活蛋白则可以使核糖体失活，抑制蛋白质合成，对多种害虫和病原微生物具有毒杀作用。将Chi基因和Rip基因构建成双价基因，有望获得比单一基因更优异的抗病虫效果，为大豆抗病虫育种提供新的思路和方法。因此，开展ChiRip双价基因对大豆的遗传转化及转基因株系的培育研究具有重要的理论和实践意义。

二、实验材料与方法

（一）实验材料

大豆品种：选用当地广泛种植、综合性状优良但抗病虫性较弱的大豆品种“中黄13”作为受体材料。

基因与载体：Chi基因和Rip基因均来自已克隆的抗病虫植物，构建成携带ChiRip双价基因的植物表达载体pCAMBIA1301-ChiRip，该载体含有潮霉素抗性基因作为筛选标记。

菌株与培养基：农杆菌菌株为EHA105，用于介导大豆遗传转化。培养基包括大豆种子萌发培养基、农杆菌培养基、共培养基、筛选培养基、分化培养基和生根培养基等，其配方根据相关文献并结合本实验实际情况进行优化。

（二）实验方法

大豆无菌苗的制备：选取饱满、无病虫害的“中黄13”大豆种子，用75%乙醇浸泡30s，再用0.1%HgCl?溶液消毒10min，无菌水冲洗5-6次。将消毒后的种子接种到萌发培养基上，在25℃、光照16h/d的条件下培养，待种子萌发长成无菌苗。

农杆菌介导的遗传转化：取无菌苗的子叶节作为外植体，将外植体浸泡在培养好的农杆菌菌液中（OD???=0.5-0.6），侵染15-20min。取出外植体，用无菌滤纸吸干表面菌液，接种到共培养基上，在22℃、黑暗条件下共培养3d。

转化体的筛选与再生：将共培养后的外植体转移到含有潮霉素（50mg/L）的筛选培养基上，在25℃、光照16h/d的条件下培养，每2周更换一次培养基，筛选抗性芽。待抗性芽长至2-3cm时，将其切下接种到分化培养基上，促进芽的伸长和分化。当幼苗长至4-5cm时，将其转移到生根培养基上诱导生根，获得完整的转基因植株。

转基因植株的鉴定：

PCR鉴定：提取转基因植株和非转基因对照植株的基因组DNA，设计Chi基因和Rip基因的特异性引物，进行PCR扩增。若扩增出与目的基因大小一致的片段，则初步判断为阳性植株。

Southernblot鉴定：选取PCR阳性植株，提取其基因组DNA，用限制性内切酶酶切后，进行Southernblot分析，以确定目的基因在大豆基因组中的整合情况，包括整合拷贝数等。

RT-PCR鉴定：提取阳性植株的总RNA，反转录合成cDNA，进行RT-PCR扩增，检测目的基因的转录表达情况。

三、实验结果与分析

（一）遗传转化效率

通过上述遗传转化方法，共接种外植体500个，经过筛选和再生培养，最终获得再生植株80株。经PCR鉴定，其中阳性植株25株，遗传转化效率为5%。转化效率受到多种因素的影响，如外植体的状态、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养条件等，后续可进一步优化这些参数以提高转化效率。

（二）转基因植株的分子鉴定结果

PCR鉴定：对25株PCR阳性植株进行扩增，均能得到与Chi基因（约1000bp）和Rip基因（约800bp）大小一致的特异性片段，而非转基因对照植株则无扩增产物，表明目的基因已初步整合到大豆基因组中。

Southernblot鉴定：选取5株PCR阳性植株进行Southernblot分析，结果显示其中3株为单拷贝整合，2株为双拷贝整合，说明目的基因以不同的拷贝数整合到大豆基因组中。

RT-PCR鉴定：对5株Southernblot阳性植株进行RT-PCR分析，均能扩增出目的基因的cDNA片段，表明ChiRip双价基因在转基因大豆植株中能够正常转录表达。

（三）转基因株系的抗病虫性鉴定

选取3个单拷贝整合且目的基因表达量较高的转基因株系（T?代），同时以非转基因“中黄13”作为对照，进行抗病虫性鉴定。

抗病性鉴定